培養ニンジン細胞のチューブリンcDNAのクローニングとその解析

• Project/Area Number: 62540505
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 植物生理学
• Research Institution: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 岡村 昭治 富山医科薬科大学, 薬学部, 助教授 (60019122)
• Project Period (FY): 1987
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1987)
• Budget Amount: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 1987: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: アミノ酸配列 / 塩基配列 / 高等植物培養細胞 / cDNA / チューブリン遺伝子 / ニンジン / 発現ライブラリー

Research Abstract

低温処理した, チューブリンmRNAの含量が高いと予想される時期のニンジン細胞よりpoly(A)^+RNAを抽出し, それを鋳型としてcDNAを合成した. このcDNAを〓gt〓〓ファージのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のEcoRI切断部位に挿入し, 21万の異ったcDNAに対する組み換え体より成るライブラリーを作製した. IPTGにより誘導, 発現させた融合蛋白をトリ脳β-チューブリンに対するモノクローン抗体によりスクリーニングし, 反応陽性のプラークを得た. このプラークを純化し組み込まれたcDNAを切り出し, M13ファージに再クローニングしてサンガー法による塩基配列の決定をおこなった. 組み込まれたcDNAは168bpで, その塩基配列は終止コドンTAAを含み, それより上流にチューブリン特有の酸性アミノ酸クラスターが存在した. またその上流にはスクリーニングに用いた抗体の認識部位とされているアミノ酸配列部位が存在することより, このcDNAはニンジンβ-チューブリンのC末端39アミノ酸に相当する部分と, それに続く3'-非翻訳部の一部の配列を有するmRNAの断片に相当すると推定された. チューブリンのC末端の酸性アミノ酸クラスターの部分は, 既知のチューブリン間で非常に変化に富んだ部分であり, チューブリンの重合や機能の調節と深くかかわりがあると考えられている. 今回得られたニンジンβ-チューブリンのcDNAを既知の他の生物種由来の相当部位と比較した結果, 次の二つの興味ある事実が示された. 1.この遺伝子はクラミドモナスや酵母由来のものよりも, トリ由来のβ-4チューブリン遺伝子と比較的似ており, アミノ酸レベルで85%, 翻訳領域でのヌクレオチドレベルで77%の相同性を示した. 2.チューブリン遺伝子は特にG.Cを含んだコドンを好んで選択しているといわれているが, この遺伝子に関してはA_1Tを含むコドンの使用が多く見られた. 今後は今回得られたcDNAをプローブとして全長cDNAをクローニングすることと, 他のβ-チューブリン遺伝子の検索を進めて行く予定である.

Research Products

• [Publications] 岡村昭治: BIOCHEMISTRY INTERNATIONAL.