骨中γ-Carboxyglutamic Acid含有蛋白に関する研究-蛋白の精製, 抗体の作製, および免疫組織化学的研究

• Project/Area Number: 62570810
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Morphological basic dentistry
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 賀来 亨 東日本学園大学, 歯学部, 助教授 (60133253)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大内 知之 東日本学園大学, 歯学部, 助手 (20194079)
• Project Period (FY): 1987
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1987)
• Budget Amount: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 1987: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: Bone γ-carboxyglutamic acid / BGP / ABC法 / 酵素抗体法

Research Abstract

骨組織は69%の無機質, 22%の有機質ならびに9%の水より構成される. 有機質の90%はtype I コラーゲンで残りが非コラーゲン蛋白である. BGPは非コラーゲン蛋白の主要な成分であり, その20%を占める.
1.BGPの精密 1)粉砕骨の作製:ポリトロンRT10/35で試みたが, 粉砕に長時間を要したので, フリーザー/ミル No.6700を用い, 比較的短期間に微細粉砕骨を作製できた. 2)Price etalの方法に準じて精製を試みたが, 蛋白収量が悪く, Gundberg etalの方法に準じて行った. ア.脱灰は0.5%EDTA,pH8.0, 4°C, Protein inhibitorを添加し行った. 脱灰後, 透析を行う(透析膜Cut off10000). イ.Sephade×G75gelにかけ分子量約10000に相当する部分を集めた. ウ.限界濾過器の濃縮を行わず, 必要に応じ, 凍結乾燥を行った. エ.DE53(Whatman)を用い, イオン交換カラムクロマトグラフィーを2回行った. オ.精密BGPとした. 精密BGPは脱イオン水で透析脱塩を行い, 凍結乾燥した. 3)免疫は家兎に免疫した. 4)骨組織標本作製:ホルスリン固定後, EDTA脱灰とした.
2.免疫組織化学的染色はAvidin-Biotin Complex(ABC)法により行った.
3.BGPの局在: 骨芽細胞, 骨細胞, これらの細胞に近接する類骨基質辺縁に認めた. 若干, 骨髄細胞にBGPの染色が認められた. 軟骨細胞には局在は認められなかった.
第30回歯科基礎医学会で上記演題名で報告する予定である.