コンリアセチルトランスフェレーズのcDNAクローニングとその遺伝子発現機構の解析

Research Project

Project/Area Number	62571007
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Biological pharmacy
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience
Principal Investigator	石田功 (財)東京都神経科学総合研究所, 主任研究員 (10142150)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	横山恵美子 (財)東京都神経科学総合研究所, 主事研究員 (10150195)
Project Period (FY)	1987
Project Status	Completed (Fiscal Year 1987)
Budget Amount *help	¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000) Fiscal Year 1987: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Keywords	コリンアセチル転移酵素 / 組換えDNA / 運動ニューロン
Research Abstract	我々は最近ウシ脳の線条体よりコリンアセチル転移酵素(ChAT)を部分精製したのちマウスを免疫し, 単クローン抗体を3種樹立することに成功したが, 本年度はこの抗体を用いて以下の研究を進めた. (1)ChAT蛋白質の精製とアミノ酸配列の解析:上記単クローン抗体をセフアローズに結合してイムノアフィニティークロマトグラフィを作成した. ウシ脳の線条体よりChATを部分精製したのちイムノアフィニティカラムに吸着させ, Tris-HCI暖衡液で洗浄後NaClとUreaによってChATを溶出した. この段階でChATはほゞ純品に近い状態であったが, 微量の混入蛋白質を除くためさらにSDS電気泳動により68KDaのChATを分離溶出した. そのアミノ酸配列を決定するためChAT蛋白をトリプシンやリジンエンドペプチターゼで分解し, 逆層液体クロマトグラフィーにより蛋白質断片を分離する条件を検討中である. (2)ChATのcDNAクローニング:我々が作成した単クローン抗体SDSで変性したChATを認識するので, この抗体を用いてcDNAクローニングを行っている. すなわち, ウシ脊髄前角のPoly(A)^+RNAより二重鎖cDNAを調整し, これを発現ベクターλgtll11に組み込んだのちcDNAライブラリーを作成し, 単クローン抗体でスクリーニングした. その結果7個の陽性クローンを得たがこのうち3クローンは免疫反応が強くお互いに交叉すること, またノーザンブロットでは脳と脊髄に特異的であることから, ChATのcDNAの可能性が大きいと考えられる. このクローンについて制限酵素マップを作成し, 塩基配列も一部決定した. (1)の結果と合わせてこれがChATのcDNAであるかどうかが明らかになるであろう.