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¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 1987: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
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| Research Abstract |
Lysosome H^+-ATPaseは NEM感受性, oligomycinやefrapeptinに耐性, bicarbonateによって活性化されない, 等の点でmitochondriaのF_0F_1-ATPase(MF_0F_1)とは明らかに異なっているが, その他の諸性質はMF_0F_1と極めて類似しており, 本ATPaseの精製が極めて困難な理由になっている. 先ず, ラット肝tritosomeより本H^+-ATPaseを部分精製したが, nemに強い感受性を示すと同時にoligomyoinやbicarbonateに対する感受性も上昇し, 抗F_1β抗血清を用いたimmunablotでも, 48Kの蛋白が染色され, MF_0F_1の混入が多いことが分かった. そこで, MF_0F_1を切除する方法を検討した. 先ず, Triton X-114で, MF_0F_1を選択的に可容化・除去出来ることが抗F1β抗血清によるimmunoblotの他efrapeptin感受性・bicarbonateによる活性化等の指標で確認された. しかしながら, Triton X-114処理後 H^+ATPaseの可容化が極めて困難になった.
そこで, これに代わる可容化剤を検討した結果, C_<12>E_9によりこの問題点が解決された. 即ち, ラット肝tritosomeの膜ghostを, 10%glycerol及び200μg/ml・phosphatidylcholine存在下に0.5%C_<12>E_9で抽出すると, lysosome H^+・ATPaseを優先的に抽出できた. 更にhydroxylapatiteによる吸着やglycerol密度勾配遠心によって, MF_0F_1より分子サイズの小さいATPaseとして回収できた. C12E9抽出標品を0/02%O_<12>E_9存在下に末変性acrylamide密度勾配disc電気泳動後, 活性染色すると, MF_0F_1よりも移動度の大きなバント(見かけの分子量=40万弱)としてlysosomeのH^+-ATPaseを固定できた.
以上の結果より, lysosome H^+-ATPaseはMF_0F_1とは全く異なる構造のATPaseであることが示唆された. 現在, H^+ATPaseに対するmonoclonal抗体の作製に鋭意取り組んでいるが, 通常の方法では調製困難であることもはっきりしてきた. 各種方法を組み合わせて, lysosome H^+-ATPaseの構造の解明を早急に果たしたいと考えている.
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