酵母ペルオキシゾームの複合共役酵素系を利用した物質変換系の開発

Research Project

Project/Area Number	62616505
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	田中渥夫京都大学, 工学部, 教授 (80026088)
Project Period (FY)	1987
Project Status	Completed (Fiscal Year 1987)
Budget Amount *help	¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000) Fiscal Year 1987: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Keywords	炭化水素資化性酵母 / Candida tropicalis pK 233 / ペルオキシゾーム / 脂肪酸β-酸化系 / 複合共役酵素系 / エノイルーCoAヒドラターゼ / 3-ヒドロキシアシルーCoAデヒドロゲナーゼ / bifunctional酵素
Research Abstract	酵母ペルオキシゾーム内に局在する脂肪酸の活性化とβ-酸化の一連の複合共役酵素系を用いた物質生産体系の創出のために, まず共役系を構成しながらも, 性質の明らかでない脂肪酸β-酸化系の第2, 第3段階の反応を司る酵素であるエノイルーCoAヒドラターゼ(ECH)と3-ヒドロキシアシルーCoAデヒドロゲナーゼ(HCD)を精製してその諸性質を調べ, 共役系におけるこれらの酵素の機能と役割を明らかにした. 炭化水素資化性酵母Candida tropicalis pK233の全菌体からECH活性のみをもち, サブユニットの分子量が3.6万の酵素が精製できたが, 一方, 同菌体の細胞分画で得たペルオキシゾームを含む画分からプロテアーゼ阻害在存在下, ECHとHCDの両活性をもつ分子量10.5万のbifundiond酵素が得られた. 両精製酵素のECH部分の諸性質は全く同じであり, また, 脂肪酸の炭素鎖長に対する広い基質特異性は, このβ-酸化系の初発酵素であるアシルーCoAオキシダーゼとよく一致していた. bifunctional酵素を種々のプロテアーゼで消化し, 両活性を追跡したところ, α-キモトリプシンはECH活性にほとんど影響を与えずに, HCD活性のみを失活させた. 消化産物の一つはSDS-PAGEでは3.6万の分子量をもち, 全菌体より得たECHのみの活性をもつ酵素ときわめてよく似たペプチドマップを示した. このことは, 本ペルオキシゾームの脂肪酸のβ-酸化系を構成する第2, 第3のステップ即ち, 水付加と還元反応に働く2つの酵素は単一ペプチド鎖上に両酵素活性をもつbifunctional酵素であり, しかも, ECH活性部位は機能的に独立したドメインを構成していることが推定された. 以上のような結果から, ECH活性のみをもつドメインとアシルーCoAオキシダーゼとを共役させることにより種々の鎖長をもち, 光学活性をもつと考えられる脂肪酸3-ヒドロキシ誘導体の生産系や完全な機能のbifunctional酵素を用いての脂肪酸の3-ケト誘導体の生産系の構築が可能であると考えられる.