DNAの構造変化とそれに及ぼす宿主因子に関する分子生物学的基礎研究

Research Project

Project/Area Number	63015013
Research Category	Grant-in-Aid for Cancer Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	岩本愛吉東京大学, 医学部医学科, 助手 (10133076)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	半田宏東京大学, 医学部医学科, 助教授 (80107432) 池田日出男東京大学, 医科研, 教授 (10012775) 吉倉廣東京大学, 医学部医学科, 教授 (60012754)
Project Period (FY)	1988
Project Status	Completed (Fiscal Year 1988)
Budget Amount *help	¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000) Fiscal Year 1988: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000)
Keywords	ウシパピローマウィルス / 遺伝子組換え / ネオマイシン耐性遺伝子 / マウス白血病ウイルス
Research Abstract	ウシパピローマウィルスシャトルベクターを用いて,動物細胞及び原核細胞における遺伝相同組換えを調べる実験系を確立した。まず第1には,1型ウシパピローマウィルスゲノムを含むシャトルベクター上に,SV40由来の約850bpのDNAをネオマイシン耐性遺伝子を挟んで同方向反復配列(pDR),又は逆向き反復配列(pIR)になるように配置した。これらをマウスC127細胞に導入し,約一カ月後に染色体外に存在するDNAを解析したところ,pDRでは約30-50%の高い頻度で相同反復配列間での交叉によりプラスミドの一部欠失が認められた。16クローンにつき制限酵素によるマッピングを行ったところすべて同一パターンを示した。このうち5クローンにつき塩基配列を決定したところ相同組換えが正確に起こっていたが,例外として1クローンにおいて塩基対のみの置換が認められた。一方,PIRの場合,染色体外にはpIRが主に検出され組換え体は極小量しか検出できなかった。即ち動物細胞において反復配列の方向性が組換え体形成に著しい影響をもたらすことがわかった。第2に,ウシパピローマウィルスシャトルベクター上に,欠損部位が異なる2個のネオマイシン耐性遺伝子を挿入し,相同組換えが起こると正常遺伝子を発現するように構築した。これを遺伝子組換え経路の異なる大腸菌に導入したところ,RecBC経路,RecE経路,RecF経路において各々異なった組換え体を検出した。各々について組換えのモデルを提出することができた。マウス白血病ウィルス(MLV)のgag蛋白であるp30蛋白を持続発現する細胞株を樹立するため,MLVのgagとプロテアーゼ遺伝子を含む部分を,β-アクチンプロモーターを有する発現ベクターに組み込みマウスの細胞に導入したところ,約85Kbの蛋白が検出されたもののgag蛋白の前駆体となるp65蛋白やp30へのプロセシングは認められなかった。