絶対共生細菌の生産する耐熱性β-チロシナ-ゼ遺伝子のクロ-ン化と共生機構の解明

Research Project

Project/Area Number	63470113
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	発酵・醸造
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	別府輝彦東京大学, 農学部, 教授 (80011873)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	吉田稔東京大学, 農学部, 助手 (80191617) 堀之内末治東京大学, 農学部, 助教授 (80143410)
Project Period (FY)	1988 – 1989
Project Status	Completed (Fiscal Year 1989)
Budget Amount *help	¥6,900,000 (Direct Cost: ¥6,900,000) Fiscal Year 1989: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000) Fiscal Year 1988: ¥4,400,000 (Direct Cost: ¥4,400,000)
Keywords	好熱性共生細菌 / β-チロシナ-ゼ / トリプトファナ-ゼ / 遺伝子クロ-ニング / 共生 / 絶対共生細菌 / β-チロシナーゼ / クローニング
Research Abstract	好熱性共生細菌Symbiobacterium thermophilumの生産する耐熱性β-チロシナ-ゼ(Tyase)酵素蛋白の精製法の確立、Tyase蛋白のCNBr化学分解後にHPLCで分取した2ペプチドの部分アミノ酸配列の決定により、本Tyaseは我々が以前クロ-ン化、塩基配列決定したトリプトファナ-ゼと非常に相同性が高いことが明らかになった。従って、TPaseをプロ-ブとしてTyaseのクロ-ン化を試みたが、取得したものはTyaseでなく、本菌の有する第2のTPaseであることが判明した。なお、このTPaseについては塩基配列の決定および大腸菌での大量発現に成功した。しかしその後、TPaseをプロ-ブとして弱くハイブリダイズするDNA断片を取得し、そのC末端付近の塩基配列決定を行ったところ、TPaseと約50%という高い相同性を保持していて、これがTyaseであると推定している。この遺伝子の全長を取得すべく、サザンハイブリダイゼ-ションを行い、約4.3kb断片をクロ-ン化して、現在この全塩基配列の決定および大腸菌での大量発現させた蛋白のアッセイによるβ-チロシナ-ゼとしての確認を続行中である。一方、S.thermophilumと新種のBacillus属の一菌株との共生機構の解明については、その後共生因子の検定菌であるS.thermophilumのBacillus菌よりの分離法の改良など種々の検討を加え、Bacillusの菌体破砕上清画分に何らかの共生因子が存在することが示唆された。現在、共生因子の精製、その同定を行なうと共に、S.thermophilumが純粋培養可能となった後に、その分類上の位置、性質等を調べるつもりでいる。