酵素触媒反応による有機酸のボルタンメトリー

Research Project

Project/Area Number	63540434
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	分析・地球化学
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	長谷部清北海道大学, 理学部 (70000859)
Project Period (FY)	1988
Project Status	Completed (Fiscal Year 1988)
Budget Amount *help	¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000) Fiscal Year 1988: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Keywords	遊離酵素法 / ボルタンメトリー / 微分パルスポーラログラフィー / クエン酸 / ピルビン酸 / クエン酸リアーゼ / セッコウ / スポーツドリンク
Research Abstract	有機酸の特異的分析法として、高選択的である酵素触媒反応を利用し、高感度な検出法としての微分パルスポーラログラフィーを用いた新しい分析法を開発した。本研究では、有機酸としてクエン酸を選んだ。クエン酸は生体における代謝系としてのTCA回路の重要な中間体であるばかりでなく、食品工業における添加物、建築業界におけるセッコウの凝結遅延剤、助晶剤などに広く用いられている。電気分析的に不活性なクエン酸を2種類の酵素、すなわち、クエン酸リアーゼおよびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを同じ溶液に共存させ、クエン酸に作用させ、ピルビン酸に変換する。生成したピルビン酸を電気化学的に還元し、このとき得られる還元電流の濃度依存性を検討した。以下に反応式を示す。クエン酸〓DBクエン酸リアーゼ(/)→〓DBオキサロ酢酸オキサロ酢酸〓DBオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ(/)→〓DBピルビン酸ピルビン酸〓DBH〓DI+〓DI,E〓DI-〓DI(/)→〓DB乳酸過剰量の酵素は、電気分解の際に電極に吸着し、ピルビン酸の還元反応を妨害するので、あらかじめ反応終了後、過塩素酸イオンの添加により除去した。クエン酸のピルビン酸への変換における反応時間および反応温度の関係は、0.2Mトリス-酢酸緩衝溶液(pH7.8)において35℃では20分以上で、また温度以外の条件を一定にして反応温度を変化させたとき、30〜40℃で定量的に変換された。さらに、ピルビン酸への変換のための最適pH領域は7.0〜8.6の広い範囲であった。電解過程における条件では、電解液のpHは3.8〜4.2で電解電流は最大かつ一定であり、緩衝能を考慮して0.2mとした。電位掃引速度は、5mV/S、パルス電圧は100mVが最適であった。確立した条件下で0.5〜20μMのクエン酸の定量が可能であり、本法を市販セッコウおよびスポーツドリンク中のクエン酸の定量に応用し、好結果が得られた。