ウシ歯髄細胞培養中に発現されるコラゲナーゼインヒビターの遺伝子の研究

• Project/Area Number: 63570882
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional basic dentistry
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 深澤 加與子 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (60064698)
• Project Period (FY): 1988
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1988)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1988: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: コラゲナーゼインヒビター / ウシ歯髄細胞 / cDNAライブラリー

Research Abstract

1.実験方法
(1)ウシ末萌出歯髄細胞を、10%FBSを含むMEM倍地で、5×10^7個まで増殖し、これを無血清倍地に換え50時間後に細胞を集めた。
(2)RNAの抽出はグアニジン酸ホットフェノール法、mRNAは、オリゴdTセルロースを用いて精製した。
(3)アマシャム社の合成システムによりmRNAよりcDNAを合成した。
(4)cDNAは入gt10と入gt11にクローニングし、それぞれE.COli L514とE.coli Y1090に感染させた。
(5)ライブラリーノスクリニングはコラゲナーゼインヒビターのモノクロナール抗体ならびに合成DNAプローブで行なった。
2.実験結果
(1)6×10^6pfuの入gt11cDNAライブラリーが得られ組換率は98.5%と良い結果が得られた。コラゲナーゼインヒビター(C.I)のモノクロナール抗体によるスクリーニングは、2×10^3pfu/plateを50枚行なったが陽性のブラークは得られなかった。
(2)6×10^5pfuの入gt10cDNAライブラリーが得られ、組換率は78%であった。これをN末端アミノ酸より推定合成した25塩基のDNAプローブで、2×10^3pfu/plate 50枚スクリーニングした所、3プレートに1つの割合で陽性プラークを得た。しかしこれを再プレートしても陽性プラークが増加しなかった。
3.考察ならびに今後の計画
C.I.のcDNAを組み込んだクローンを得ることができなかった原因として(1)mRNAが取れていない。(2)cDNAの合成がうまくいっていない。(3)材料が不適当(4)スクリーニングに用いた抗体や合成プローブが不適当など考えられる。これらの点を検討し再度実験を行う予定。