固定化オペロンを用いたRNAポリメラーゼのDNA上運動の解析
| Project/Area Number |
63580214
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
生物物性学
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
嶋本 伸雄 広島大学, 総合科学部, 助手 (20127658)
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| Project Period (FY) |
1988
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1988)
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| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 1988: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
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| Keywords | 固定化オペロン / ビデオチン / アビジン / 転写開始 / RNAの伸長 / 大腸菌RNAポリメラーゼ / σサブユニット |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、大腸菌のシステムに、担体に固定化した鋳型DNA(固定化オペロン)を用いた新しい手法で、転写に伴うRNAポリメラーゼを中心とする転写複合体の、時間的な変化を検出することである。つまり、素早い混合によって転写を同調して開始させ、続いて、転写複合体に結合した蛋白分子と遊離の分子とを、急速ろ過または大過剰希釈によって分離して、複合体の構造を明らかにするというものである。
本年度の成果は、
1.λファージの強いプロモーターPRを持つ1.2kbのλDNAをpBR322にクローンし、EcoRI端をビオチン化してアビジンアクリルアミドに固定して、固定化オペロンを作製した。
2.同期した転写を開始して、2秒から10秒後の1000倍に転写時と同じ緩衝液で大過剰希釈して、低速遠心で遊離の蛋白を除き、転写複合体中のσサブユニットを定量した。σ解離は、大過剰希釈により凍結され、約5秒でσサブユニットが解離する過程が追跡できた。
3.希釈緩衝液中にATPやCTPが存在すると、2秒でもσは解離しており、σ解離は凍結されなかった。つまり、σの解離が凍結されたのは、ヌクレオシド三燐酸が除かれたためであった。ATPの非水解アナログを用いて、ATPのβγ燐酸ジエステル結合がσ解離に必要であることが示された。このことは、σの解離には、転写の開始とヌクレオシド三燐酸のβγ燐酸ジエステル結合の水解が必要であり、RNAの伸長だけでは不十分であることを明らかにした。
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Research Products
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