カチオンポンプ

Research Project

Project/Area Number	63617001
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	安楽泰宏東京大学, 理学部, 教授 (20012643)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	川喜田正夫東京大学, 教養学部, 助教授 (00012740) 金沢徹旭川医科大学, 医学部, 教授 (80028141) 松井英男杏林大学, 医学部, 教授 (50086485) 中尾真東京医科歯科大学, 医学部, 教授 (10013781) 旭正名古屋大学, 農学部, 教授 (10023392)
Project Period (FY)	1987 – 1989
Project Status	Completed (Fiscal Year 1988)
Budget Amount *help	¥36,900,000 (Direct Cost: ¥36,900,000) Fiscal Year 1988: ¥36,900,000 (Direct Cost: ¥36,900,000)
Keywords	プロトンポンプ / カチオンポンプ / H^+-輸送性ATPase / カチオン輸送性ATPase / 肝リソゾーム / 筋小胞体 / 酵母液胞
Research Abstract	本班は真核細胞オルガネラ膜のプロトンノカチオンポンプ(イオン輸送性ATPases)の生化学的反応機構、分子構築、遺伝子発現機構の研究を推進し、下記の新知見を得た。安楽班員は非定常状態酵素反応解析、^<60>Co放射実験、単クローン抗体を用いるトポロジー解析により、酵母液胞膜H^+ATPaseが活性中心〓サブユニット(64KDa)の3量体を含む分子量540KDaの巨大分子を構築すること、プロトンポンプ活性の発現のためには活性中心同志の正の協同反応が必須であることを示し、本酵素の反応機構モデルを提出した。旭班員および大熊班員はケツルアズキ液胞およびラット肝リソゾームのプロトンポンプの構造と機能に関する詳細な研究を行い、ポンプ本体の分子構築とサブユニットに関する新知見を得た。中尾班員はラットNa^+/K^+-ATPaseのαサブユニット遺伝子のα3サブセットの発現を実証するため、α3cDNAをBalb/C3T3細胞に導入し、α3mRNAを検出する実験系を開発した。この新しいスクリーンニング法によりR6^+をとりこむポジティブクロンを得、この細胞中でα3由来のウワバイン高親和性αサブユニットの発現を実証した。松井班員はラット胚大脳由来の初代培養ニューロンを用い、細胞成熟にともなうNa^+ポンプ活性の増加とNa^+/K^+ATPaseアイソザイムの検索を行った。ニューロンのNa^+ポンプ活性は細胞の成熟にともなうジギタリス高感受性ATPaseの出現と対応して増加することを認めた。金沢班員は筋小胞体のCa┣D12+LATPaseが蛍光プローブAEDANSによって特異的に標識されることを示し、この蛍光の強度および異方性変化がCa┣D12+┫D1結合と酵素の活性化、ATP結合とリン酸化、EP中間体の分解の各過程とどのように対応するかを詳細に解析した。川喜田班員は筋小胞体Cd┣D12+┫D1ATPaseがAP3PLによって特異的に失活することに着目し、Ca┣D12+┫D1結合にともなう分子内機能性リジンの近接性変化と活性発現の相関性を明きらかにした。