T.ferrooxidansの亜硫酸酸化酵素の精製及び同酵素遺伝子のクローニング

Research Project

Project/Area Number	63617507
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	杉尾剛岡山大学, 農学部, 助教授 (20033269)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	稲垣賢二岡山大学, 大学院自然科学研究科, 助手 (80184711)
Project Period (FY)	1988
Project Status	Completed (Fiscal Year 1988)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 1988: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	Thiobacillus ferrooxidans / 硫黄酸化 / 亜硫酸酸化 / sulfite:ferric ion oxidoreductase
Research Abstract	鉄酸化細菌T.ferrooxidansは一般に、重金属イオンを多量に含む酸性無機環境下に生息し、バクテリアリーチング及び酸性鉱山排水処理等に利用されている。著者はT.ferrooxidansAP19-3株中に、Fe^<3+>を電子受容体にして元素硫黄及び亜硫酸を酸化する酵素sulfur:ferric ion oxidoreductase及びsulfite:ferric ion oxidoreductaseの存在を明らかにし、両酵素と鉄酸化酵素が鉄イオンでリンクした新しい硫黄酸化経路の存在を提案している。前者はすでに均一標品として単離がすんでいるので、sulfite:ferric ion oxidoreductaseの精製、諸性質の検討、同酵素遺伝子のクローニングを目的とした。 1%Nonidet P-40を用いる事によって、AP19-3株の細胞膜画分からsulfite:ferric ion oxidoreductaseを可溶化した。可溶化標品を用いての亜硫酸酸化の諸性質は、膜画分で得られた結果と同じであった。亜硫酸に対するkmは71μM、Fe^<3+>に対するkmは1mM、分子量はゲル濾過法で440000と決定した。酵素活性は1mMのFe^<2+>によって完全に阻害されたが、この結果はFe^<3+>が本酵素の電子受容体である事を支持する。可溶化画分をDEAE-Toyopeal650Sで二回分画後、4%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し活性画分をゲルカットする事によって得た。このものをアガロース-アクリルアミドゲル電気泳動する事によって比活性が285倍に上昇した標品を得た。この標品はまだ不純タンパク質を含んでいたので、現在さらに精製を進めている。精製sulfur:ferric ion oxidoreductaseを用いて、固体硫黄酸化の際必須とされるGSHの役割について検討し、本酵素の真の基質が、固体硫黄とGSHが非酵素的に反応して生じる硫化水素である事を明らかにした。 T.ferrooxidans AP19-3株の洗浄細胞が、元素硫黄を電子供与体にしてM_O^<6+>を還元する能力を持っている事を明らかにした。さらに高度に精製したsulfur:ferric ion oxidoreductaseがMo^<6+>の還元を触媒し、この還元がFe^<3+>によって競争阻害を受ける事から、本酵素はFe^<3+>とMo^<6+>の両者を還元できると結論した。