高い水素発生活性を実現する[FeFe]型ヒドロゲナーゼの構造デザイン

• Project Area: Chemical conversion of solar energy by artificial photosynthesis: a breakthrough by fusion of related fields toward realization of practical processes
• Project/Area Number: 15H00886
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 浅井 智広 立命館大学, 生命科学部, 助教 (70706564)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2016: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2015: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ヒドロゲナーゼ / Hクラスター / 嫌気 / 緑色硫黄細菌 / Chlorobaculum tepidum / コドン最適化 / 光合成水素生産 / HydA1 / 水素発生 / [FeFe]ヒドロゲナーゼ / GFP / 二次構造形成

Outline of Annual Research Achievements

緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの[FeFe]ヒドロゲナーゼHydA1 は、コンパクトで有りながら非常に高い水素発生活性をもつ酵素として知られているが、活性中心であるHクラスターの形成と保持に厳密に嫌気的な環境を必要とし、生化学的な解析や応用研究が困難である。本研究課題では、酸素分圧1 ppm 以下の嫌気環境でのタンパク質生産を容易に実現できる、絶対嫌気性の光合成細菌Chlorobaculum tepidumの外来遺伝子発現系を利用し、高い水素発生活性を保持したHydA1の大量生産系を確立することを主な目的としていた。
28年度までの研究により、C. tepidumにおいて高レベルのタンパク質発現は遺伝子のN末端領域の塩基配列に強く依存することを明らかにした。29年度はこの研究成果を利用し、Hクラスター形成に必要な成熟化タンパク質であるHydE、HydF、HydGのHydA1との高レベル共発現を試みた。全長にわたるコドン使用頻度の最適化と、N末端に付加するアフィニティータグの塩基配列を検討した結果、Strepタグ付きの遺伝子の導入によってC. tepidum内でHydEFGを高発現できることがわかった。HydA1と共発現させた結果、ほぼ全てのHydA1にHクラスターを保持させることに成功した。
驚くべきことに、HydA1とHydEFGのC. tepidum共発現株は、培養中に光依存的に水素ガスを発生させていることがわかった。HydA1は本来、光合成伝達系で働くフェレドキシンPetFをプロトン還元の電子供与体としているが、その分子認識は厳密ではなく、C. tepidumの細胞内では別の電子供与体が機能している可能性が示唆された。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] 酸素発生型光合成の成立過程とその実証方法の再考 (2016)
  • Author(s): 浅井 智広, 塚谷 祐介
  • Journal Title: 光合成研究 Volume: 26 Pages: 43-58
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Orientations of Iron-Sulfur Clusters FA and FB in the Homodimeric Type-I Photosynthetic Reaction Center of Heliobacterium modesticaldum (2016)
  • Author(s): T. Kondo, M. Matsuoka, C. Azai, S. Itoh, H. Oh-oka
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 120 Issue: 18 Pages: 4204-4212
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.6b01112
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mutation-induced perturbation of the special pair P840 in the homodimeric reaction center in green sulfur bacteria (2016)
  • Author(s): C. Azai, Y. Sano, Y. Kato, T. Noguchi and H. Oh-oka
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: ー Issue: 1 Pages: 19878-19878
  • DOI: 10.1038/srep19878
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Menaquinone as the secondary electron acceptor in the type I homodimeric photosynthetic reaction center of Heliobacterium modesticaldum (2015)
  • Author(s): T. Kondo, S. Itoh, M. Matsuoka, C. Azai and H. Oh-oka
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 119 Issue: 27 Pages: 8480-8489
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.5b03723
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 絶対嫌気性の光合成細菌Chlorobaculum tepidumの異種遺伝子発現系を利用した緑藻[FeFe]型ヒドロゲナーゼの細胞内成熟化 (2017)
  • Author(s): 池田 祐輔、武藤 梨沙、波佐間 雄世、大岡 宏造、栗栖 源嗣、寺内 一姫、浅井 智広
  • Organizer: 第58回 日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 鹿児島大学 郡元キャンパス（鹿児島県鹿児島市）
  • Year and Date: 2017-03-17
• [Presentation] N-terminal Nucleotide Sequence Dependency of Anaerobic Protein Overexpression in the Photosynthetic Green Sulfur Bacterium Chlorobaculum tepidum (2017)
  • Author(s): Y. Ikeda, Y. Hazama, R. Mutoh, A. Norimitsu, H. Oh-oka, G. Kurisu, K. Terauchi, C. Azai
  • Organizer: 2017 International Conference on Artificial Photosynthesis
  • Place of Presentation: Suzaku Campus, Ritsumeikan University, Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2017-03-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 光合成反応中心複合体に潜む構造機能相関の実験的探索 (2017)
  • Author(s): 浅井 智広
  • Organizer: 第9回 BKCバイオインフォマティクス研究会
  • Place of Presentation: 立命館大学 びわこ・くさつキャンパス（滋賀県草津市）
  • Year and Date: 2017-02-01
  • Invited
• [Presentation] Functions of Evolutionally Conserved antenna chlorophylls in type-1 photosynthetic reaction centers (2016)
  • Author(s): C. Azai
  • Organizer: Photosynthetic and Respiratory Complexes: From Structure to Function
  • Place of Presentation: The Van der Valk Hotel Verviers, Vervier, Belgium
  • Year and Date: 2016-08-14
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Mutagenic analysis of conserved antenna chlorophylls in type-1 photosynthetic reaction centers (2016)
  • Author(s): C. Azai, T. Kondo, K. Okuda, K. Terauchi, S. Itoh, H. Oh-Oka
  • Organizer: The 17th International Congress on Photosynthesis Research
  • Place of Presentation: MECC, Maastricht, The Netherlands
  • Year and Date: 2016-08-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural homology around the special pair chlorophylls among type-1 reaction centers (2016)
  • Author(s): C. Azai
  • Organizer: Satellite Meeting on Photosynthesis
  • Place of Presentation: Kyoto University Seminar House (Yoshida Campus), Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2016-07-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Influence of codon bias on the anaerobic protein overproduction in the phototrophic green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum (2016)
  • Author(s): Y. Hazama, A. Norimitsu, C. Azai, K. Terauchi
  • Organizer: Satellite Meeting on Photosynthesis
  • Place of Presentation: Kyoto University Seminar House (Yoshida Campus), Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2016-07-01
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 緑色硫黄細菌での異種遺伝子発現におけるコドン使用頻度の影響 (2016)
  • Author(s): 波佐間 雄世，則光 明日美，浅井 智広，寺内 一姫
  • Organizer: 第7回 日本光合成学会年会
  • Place of Presentation: 東京理科大学 葛飾キャンパス（東京都葛飾区）
  • Year and Date: 2016-05-27
• [Presentation] 緑色硫黄細菌Chlorobaculum tepidum におけるGFP 発現の塩基配列依存性 (2016)
  • Author(s): 波佐間 雄世、則光 明日美、浅井 智広、寺内 一姫
  • Organizer: 第10回 日本ゲノム微生物学会年会
  • Place of Presentation: 東京工業大学70周年記念講堂 （東京都目黒区）
  • Year and Date: 2016-03-04
• [Presentation] 緑藻型[FeFe]ヒドロゲナーゼとH クラスター生合成系の緑色硫黄光合成細菌における嫌気的共発現 (2016)
  • Author(s): 池田 祐輔、波佐間 雄世、武藤 梨沙、浅井 智広
  • Organizer: 第4回公開シンポジウム 新学術領域研究「人工光合成による太陽光エネルギーの物質変換：実用化に向けての異分野融合」
  • Place of Presentation: 東京理科大学 図書館大ホール （東京都葛飾区）
  • Year and Date: 2016-01-29
• [Presentation] 多孔性シリカ粒子のナノ空間に埋め込まれたヘリオバクテリア反応中心コアタンパクの安定性と分光学的特性 (2015)
  • Author(s): 大岡 宏造、野路 智康、浅井 智広、武藤 梨沙、栗栖 源嗣、伊藤 繁
  • Organizer: 第53回 日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学 角間キャンパス （石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-13
• [Presentation] Construction of Artificial Heterodimeric Photosynthetic Reaction Center in the Green Sulfur Bacterium Chlorobaculum tepidum (2015)
  • Author(s): C. Azai, K. Kim, J. Harada, H. Oh-oka
  • Organizer: 15th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes
  • Place of Presentation: エバーハルト・カール大学テュービンゲン （ドイツ・テュービンゲン）
  • Year and Date: 2015-08-06
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Bacteriochlorophyll a Synthesis in the Green Sulfur Bacterium Chlorobaculum tepidum Mutant Lacking BchX, a Subunit of Chlorophyllide a Oxidoreductase (2015)
  • Author(s): C. Azai, T. Mizoguchi, H. Tamiaki, H. Oh-oka
  • Organizer: 15th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes
  • Place of Presentation: エバーハルト・カール大学テュービンゲン （ドイツ・テュービンゲン）
  • Year and Date: 2015-08-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A Rieske/Cytochrome b Complex in the Green Sufur Bacterium Chlorobaculum tedium (2015)
  • Author(s): H. Oh-oka, T. Yamamoto, R. Mutoh, C. Azai, G.i Kurisu
  • Organizer: 15th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes
  • Place of Presentation: エバーハルト・カール大学テュービンゲン （ドイツ・テュービンゲン）
  • Year and Date: 2015-08-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Heliobacterial type-I homodimer reaction center uses menaquinone as the secondary electron acceptor, at a little different location from that of phylloquinone in PSI (2015)
  • Author(s): S. Itoh, T. Kondo, C. Azai, H. Oh-oka
  • Organizer: 15th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes
  • Place of Presentation: エバーハルト・カール大学テュービンゲン （ドイツ・テュービンゲン）
  • Year and Date: 2015-08-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ホモダイマー型光合成反応中心の分子生物学的な構造機能解析 (2015)
  • Author(s): 浅井 智広
  • Organizer: 第6回 日本光合成学会年会およびシンポジウム
  • Place of Presentation: 岡山国際交流センター （岡山県岡山市）
  • Year and Date: 2015-05-22
  • Invited
• [Presentation] ホモダイマー光合成反応中心複合体の人工的ヘテロダイマー化 (2015)
  • Author(s): 浅井 智広、Kwang Kim、近藤 徹、原田 二朗、伊藤 繁、大岡 宏造
  • Organizer: 第62回 日本生化学会近畿支部例会
  • Place of Presentation: 立命館大学 びわこ・くさつキャンパス （滋賀県草津市）
  • Year and Date: 2015-05-16