光活性化を利用した[NiFe]ヒドロゲナーゼの触媒反応機構の分光学的研究

• Project Area: Stimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules
• Project/Area Number: 15H00945
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 廣田 俊 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 教授 (90283457)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2016: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2015: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: 蛋白質 / 酵素 / 光活性化 / 赤外分光法 / ヒドロゲナーゼ / 金属蛋白質 / 反応機構

Outline of Annual Research Achievements

標準型[NiFe]ヒドロゲナーゼは酸化型で安定であり、酸塩基平衡により活性準備状態Ni-SIrが触媒サイクルの1つの状態であるNi-SIaに変換され、触媒反応（H2の分解/合成）が可能となる。したがって、本酵素の触媒反応機構の理解には、Ni-SIrからNi-SIaへの変換機構の理解が不可欠であるが、その変換機構の詳細は不明であった。本年度は、103－238 Kでレーザー光(514.5 nm)照射下のFT-IRスペクトルを測定することで、Ni-SIrとNi-SIa間の酸塩基平衡の反応機構を明らかにした。まず、好気的に精製した酵素を37℃でH2と5.5時間反応させることでH2還元型酵素を調製した。次に、H2還元型酵素を5当量のフェノサフラニン(Em = －252 mV)を用いて部分的に酸化させ、主にNi-SIrとNi-SIaを含むフェノサフラニン酸化型酵素を調製した。フェノサフラニン酸化型酵素の（光照射時）－（光照射前）のFT-IR差スペクトルには、Ni-SIaのCO伸縮振動（νCO：1943 cm－1）とCN－伸縮振動（νCN：2077と2089 cm－1）に由来する正のピークおよびNi-SIrのνCO（1924 cm－1）とνCN（2056と2071 cm－1）に由来する負のピークが観測された。差スペクトルにおける正のピークは生成物、負のピークは反応物に由来し、Ni-SIrがNi-SIaに光活性化されることが明らかとなった。さらに、溶液のpHを8.0から9.6に上げるとNi-SIrの光活性化が著しく抑制されたことから、この光活性化反応ではNiとFe間の架橋配位子OH－がプロトン化され、H2O分子として解離すると解釈した。また、酵素反応を追跡するためのストップトフロー共鳴ラマン装置を開発した。これらの研究成果は[NiFe]ヒドロゲナーゼの反応機構の理解に役立つものである。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Improved Stopped-Flow Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy Device for Studying Enzymatic Reactions (2017)
  • Author(s): S. Yanagisawa, M. S. Deshpande, S. Hirota, T. Nakagawa, and T. Ogura
  • Journal Title: Journal of Raman Spectroscopy Volume: 48 Issue: 5 Pages: 680-685
  • DOI: 10.1002/jrs.5100
  • NAID: 120006334945
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Photoactivation of the Ni-SIr State to Ni-SIa State in [NiFe] Hydrogenase: FT-IR Study on the Light Reactivity of the Ready Ni-SIr State and As-isolated Enzyme Revisited (2016)
  • Author(s): H. Tai, L. Xu, S. Inoue, K. Nishikawa, Y. Higuchi, and S. Hirota
  • Journal Title: Physical Chemistry Chemical Physics Volume: 18 Issue: 32 Pages: 22025-22030
  • DOI: 10.1039/c6cp04628b
  • NAID: 120006334943
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 光照射を利用した[NiFe]ヒドロゲナーゼの活性化機構のFT-IR研究 (2017)
  • Author(s): 太虎林、許力揚、西川幸志、樋口芳樹、廣田俊
  • Organizer: 日本化学会第97春季年会
  • Place of Presentation: 慶應義塾大学日吉キャンパス（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2017-03-16
• [Presentation] 光照射を利用した硫酸還元菌由来[NiFe]ヒドロゲナーゼの活性化機構のFT-IR研究 (2016)
  • Author(s): 太虎林、許力揚、井上誠也、西川幸志、樋口芳樹、廣田俊
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
• [Presentation] [NiFe]ヒドロゲナーゼにおけるNi-SIr状態からNi-SIa状態への光活性化 (2016)
  • Author(s): 許力揚、太虎林、井上誠也、西川幸志、樋口芳樹、廣田俊
  • Organizer: 第10回バイオ関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂・もてなしドーム地下イベント広場（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2016-09-07
• [Presentation] Characterization of the Light-induced Ni-L States of [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F (2016)
  • Author(s): S. Hirota, H. Tai, K. Nishikawa, S. Inoue, and Y. Higuchi
  • Organizer: 11th International Hydrogenase Conference (Hydrogenase 2016)
  • Place of Presentation: Marseille, France
  • Year and Date: 2016-07-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural and Biochemical Studies of Hyd-2 Type [NiFe]-hydrogenase from Citrobacter sp. S-77 - Proposal of the General Mechanism of O2-tolerance of Hydrogenases (2016)
  • Author(s): Y. Higuchi, N. D. M. Noor, H. Matsuura, K. Nishikawa, H. Nishihara, K-S. Yoon, S. Ogo, H. Tai, S. Hirota, and Y. Shomura
  • Organizer: 11th International Hydrogenase Conference (Hydrogenase 2016)
  • Place of Presentation: Marseille, France
  • Year and Date: 2016-07-10
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] FT-IRとEPRを用いた[NiFe]ヒドロゲナーゼの新規中間体の特定と鉄硫黄クラスターによる反応制御機構の解明 (2016)
  • Author(s): 太虎林、西川幸志、井上誠也、樋口芳樹、廣田俊
  • Organizer: 第1６回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07
• [Presentation] Control of the Transition between Ni-C and Ni-SIa States in the Catalytic Cycle of [NiFe] Hydrogenase by the Redox State of the Proximal Fe-S Cluster (2015)
  • Author(s): Hulin Tai, Koji Nishikawa, Seiya Inoue, Masayuki Suzuki, Yoshiki Higuchi, Shun Hirota
  • Organizer: 17th International Conference on Biological Inorganic Chemistry (ICBIC17)
  • Place of Presentation: China National Convention Center (Beijing, China)
  • Year and Date: 2015-07-20
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] [NiFe]ヒドロゲナーゼの光照射で生じるNi-L状態の分光学的研究 (2015)
  • Author(s): 太虎林、西川幸志、井上誠也、樋口芳樹、廣田俊
  • Organizer: 第42回生体分子科学討論会
  • Place of Presentation: 高崎シティーギャラリー（群馬県高崎市）
  • Year and Date: 2015-06-12