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構造・電子状態の同時計測に基づく生体系感応性化学種の反応機構解析

Publicly Offered Research

Project AreaStimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules
Project/Area Number 15H00965
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Science and Engineering
Research InstitutionInstitute of Physical and Chemical Research

Principal Investigator

當舎 武彦  国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (00548993)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2016)
Budget Amount *help
¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2016: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2015: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywords生体分子分光 / 時間分解計測 / 金属タンパク質 / 酵素反応機構 / 酵素反応 / 生体分子 / 蛋白質 / X線 / 時間分解分光計測 / 金属酵素 / 一酸化窒素 / 複核鉄活性中心
Outline of Annual Research Achievements

可溶性一酸化窒素還元酵素(P450nor)の反応機構を理解するために、前年度に構築した紫外光照射により一酸化窒素(NO)を定量的に放出するケージドNOを用いた反応系を利用し、P450norの結晶試料中でのNO還元反応(2NO + NADH + H+ →N2O + H2O + NAD+)の観測を試みた。そのために、P450norの結晶試料にケージドNOとNADHを浸潤させ、紫外光照射により反応を開始させた。これまでに開発したきた結晶試料に適用可能な時間分解可視吸収計測装置を用い、P450nor結晶試料での酵素反応を追跡した結果、溶液試料の場合と同様に、活性部位のヘムが鉄3価の休止状態に、NOが結合したNO結合型、NO結合型がNADHにより二電子還元された中間体を経て、酵素反応が進行することがわかった。しかし、NO結合型および中間体の生成速度は、溶液試料の場合と比べて、結晶試料では2から3桁程度遅くなっていることが判明した。これらの情報を基盤に、X線自由電子レーザー施設SACLAを利用した時間分解X線結晶構造解析によって、P450norの反応途中にみられる化学種の構造解析に取り組んだ。SACLAでの構造解析には、微結晶を送液し、X線照射部位にフレッシュな結晶を供給するシリアルフェムト秒X線結晶構造解析(SFX)を用い、ケージドNOを利用した光駆動反応系と組み合わせることで、時間分解構造解析を行った。その結果、P450norの酵素反応における最初のステップであるNO結合型の構造を室温条件で決定することができた。また、NO結合型の次にみられる中間体は、結晶中において秒のオーダーの寿命をもつため、紫外光照射による反応開始後数秒の間に、結晶試料を凍結させることで、中間体を補足することができた。現在、補足した中間体の構造解析に取り組んでいるところである。中間体の構造が明らかになれば、P450norの反応機構を立体構造を基盤に理解することができる。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2016 Annual Research Report
  • 2015 Annual Research Report
  • Research Products

    (13 results)

All 2016 2015 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (9 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results,  Invited: 3 results) Book (1 results)

  • [Int'l Joint Research] Stockholm University(スウェーデン)

    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Int'l Joint Research] University of Liverpool(英国)

    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Journal Article] A Nearly On-axis Spectroscopic System for Simultaneously Measuring UV-visible Absorption and X-ray Diffraction in the SPring-8 Structural Genomics Beamline2016

    • Author(s)
      M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
    • Journal Title

      J. Synchro. Rad.

      Volume: 23 Issue: 1 Pages: 334-338

    • DOI

      10.1107/s1600577515018275

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] Time-resolved spectroscopic analysis of the key intermediate in the enzymatic NO reduction2016

    • Author(s)
      T. Tosha, T. Kimura, H. Takeda, S. Ishii, Y. Shiro and M. Kubo
    • Organizer
      感応性化学種が拓く新物質科学The 4th International Symposium for Young Chemists
    • Place of Presentation
      大阪大学
    • Year and Date
      2016-12-12
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] X線結晶構造解析とラマン分光の統合的利用による酵素活性中心の構造解析2016

    • Author(s)
      當舎武彦
    • Organizer
      SPring-8シンポジウム・放射光赤外研究会サテライトミーティング
    • Place of Presentation
      関西学院大学三田キャンパス
    • Year and Date
      2016-08-30
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Structural basis for effective nitric oxide decomposition in microbial denitrification2016

    • Author(s)
      T. Tosha, E. Terasaka, K. Matsumoto, H. Sugimoto and Y. Shiro
    • Organizer
      The 30th anniversary symposium of the protein society
    • Place of Presentation
      Baltimore, USA
    • Year and Date
      2016-07-16
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 脱窒酵素複合体形成による効率的な一酸化窒素分解の分子機構2016

    • Author(s)
      當舎武彦,寺坂瑛里奈,松本喜慎,杉本宏,城宜嗣
    • Organizer
      26回金属の関与する生体関連反応シンポジウム
    • Place of Presentation
      北海道大学
    • Year and Date
      2016-06-17
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] Mechanism of effective nitric oxide decomposition in microbial denitrification2015

    • Author(s)
      T. Tosha, E. Terasaka, K. Matsumoto, H. Sugimoto and Y. Shiro
    • Organizer
      Pacifichem 2015
    • Place of Presentation
      ホノルル・米国
    • Year and Date
      2015-12-18
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 亜硝酸還元酵素と一酸化窒素還元酵素の複合体形成による効率的な一酸化窒素分解機構2015

    • Author(s)
      當舎武彦,寺坂瑛里奈,松本喜慎,杉本宏,城宜嗣
    • Organizer
      第53回日本生物物理学会年会
    • Place of Presentation
      金沢大学角間キャンパス・(石川県・金沢市)
    • Year and Date
      2015-09-14
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] Molecular mechanism of effective nitric oxide decomposition by denitrification enzymes2015

    • Author(s)
      T. Tosha, E. Terasaka, K. Matsumoto, H. Sugimoto and Y. Shiro
    • Organizer
      17th International Conference on Biological Inorganic Chemistry
    • Place of Presentation
      北京・中国
    • Year and Date
      2015-07-23
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 脱窒にみられる効率的な一酸化窒素分解システムの構造基盤2015

    • Author(s)
      當舎武彦,寺坂瑛里奈,松本喜慎,杉本宏,城宜嗣
    • Organizer
      第15回日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      あわぎんホール・(徳島市・徳島県)
    • Year and Date
      2015-06-25
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] )「Structural evidence for complex formation between nitric oxide reductase and nitrite reductase2015

    • Author(s)
      T. Tosha, E. Terasaka, K. Matsumoto, H. Sugimoto and Y. Shiro
    • Organizer
      “Metals in Biology” in Wako
    • Place of Presentation
      理研和光本所・(埼玉県・和光市)
    • Year and Date
      2015-06-17
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Book] Metalloenzymes in Denitrification: Applications and Environmental Impacts2016

    • Author(s)
      Takehiko Tosha and Yoshitsugu Shiro
    • Total Pages
      27
    • Publisher
      Royal Society of Chemistry
    • Related Report
      2016 Annual Research Report

URL: 

Published: 2015-04-16   Modified: 2018-03-28  

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