SPring-8オンライン赤外分光光度計の開発とバイオ活性サイトの反応過渡種計測

• Project Area: 3D Active-Site Science
• Project/Area Number: 15H01055
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 久保 稔 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (90392878)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2016: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2015: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: 赤外分光 / 超精密計測 / X線結晶構造解析 / 生体分子 / 高性能レーザー / 生物物理 / Ｘ線 / Ｘ線結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、赤外レーザーや赤外放射光といった高輝度赤外光源を用いて、タンパク質微結晶（結晶サイズ100 μm以下）に適用可能な高感度顕微赤外分光技術を開発し、赤外分光とX線結晶構造解析との相補利用を促進することである。最終的にはX線結晶構造解析のビームラインでのon-line分光計測を目指す。X線結晶構造解析において、同一試料のon-line分光計測は、試料状態の評価、特にX線損傷の評価や反応中間体の同定などに有用である。本研究では、カビ由来一酸化窒素還元酵素（P450nor）を用いて、結晶の赤外分光の技術開発ならびにX線結晶構造解析との相補利用を進める。P450norは、脱窒において生成する細胞毒NOをN2Oにまで還元するヘム酵素である。
昨年度は常温母液環境下にある結晶の赤外測定技術を開発したが、本年度はX線結晶構造解析で通常用いられる凍結結晶に適用可能な赤外測定技術を開発した。低温の窒素ガスを結晶に直接吹き付けることで100 Kを維持した。厚み30 μm程度のP450norのNO結合型結晶に応用し、SPring-8/BL43IRにて基質NOのNO伸縮振動を観測した。その振動数の値（1853 cm-1）から、ヘムに結合したNOは中性ラジカル状態であり、N-O結合距離は1.15 オングストローム程度であることが示唆された。最近われわれは、SACLAのフェムト秒X線パルスを用いてNO結合型P450norの無損傷X線結晶構造解析に成功したが、赤外分光で評価されたN-O結合距離の情報をNO配位構造の精密化に活かすことで、赤外分光とX線結晶構造解析の相補利用例を示した（論文投稿中）。P450nor以外にも、チトクロム酸化酵素や光化学系IIに対して結晶の赤外分光とX線結晶構造解析の相補利用を試みている。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. (2017)
  • Author(s): Suga, M.†, Akita, F.†, Sugahara, M.†, Kubo, M.†, Nakajima, Y.† et al. (†equal contribution)(38人中1番目)
  • Journal Title: Nature Volume: 543 Issue: 7643 Pages: 131-135
  • DOI: 10.1038/nature21400
  • NAID: 120006344935
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A three dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. (2016)
  • Author(s): Nango, E., Royant, A.†, Kubo, M.† et al. (†equal contribution)(45名中2番目)
  • Journal Title: Science Volume: 354 Issue: 6319 Pages: 1552-1557
  • DOI: 10.1126/science.aah3497
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. (2016)
  • Author(s): Nogly, P., et al. (40人中8番目)
  • Journal Title: Nat. Commun. Volume: 7 Issue: 1 Pages: 12314-12314
  • DOI: 10.1038/ncomms12314
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A Nearly On-axis Spectroscopic System for Simultaneously Measuring UV-visible Absorption and X-ray Diffraction in the SPring-8 Structural Genomics Beamline (2016)
  • Author(s): M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
  • Journal Title: J. Synchro. Rad. Volume: 23 Issue: 1 Pages: 334-338
  • DOI: 10.1107/s1600577515018275
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Time-resolved SFX at SACLA and its application to bacteriorhodopsin photocycle (2016)
  • Author(s): M. Kubo
  • Organizer: The 2nd SACLA Workshop on Structural Biology with FELs "Update on some recent time-resolved experiments performed at SACLA & LCLS"
  • Place of Presentation: 理化学研究所・SPring-8（兵庫県佐用郡）
  • Year and Date: 2016-02-02
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Damage-free X-ray crystallographic analysis of P450nor in the NO bound form using SACLA. (2016)
  • Author(s): Kubo, M., Nomura, T., Nishida, T., Tosha, T., Sugimoto, H., Kimura, T., Takano, Y., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Ago, H., Yamamoto, M., Shiro, Y.
  • Organizer: British Biophysical Society 2016 Biennial Meeting (Selected to Oral)
  • Place of Presentation: The University of Liverpool (Liverpool L69 3BX, UK)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Time-resolved XFEL crystallography of cytochrome c oxidase: Probing the interaction dynamics between two functional sites． (2016)
  • Author(s): 久保稔
  • Organizer: 日本生物物理学会第54回年会，シンポジウム “時空間精密構造解析による生体分子活性サイトの機能解明”
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（つくば市竹園）
  • Invited
• [Presentation] タンパク質結晶の顕微赤外分光解析． (2016)
  • Author(s): 久保稔
  • Organizer: SPring-8シンポジウム・サテライトミーティング “振動分光でわかること：赤外分光の今後と方向性”
  • Place of Presentation: 関西学院大学神戸三田キャンパス（三田市学園2丁目）
  • Invited
• [Presentation] X線自由電子レーザーを用いた脱窒カビ由来NO還元酵素基質結合型の無損傷結晶構造解析 (2015)
  • Author(s): 西田拓真，當舎武彦，杉本宏，木村哲就，平田邦夫，上野剛，吾郷日出夫，山本雅貴，城宜嗣，久保稔
  • Organizer: 第88回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] SACLAを用いた脱窒カビ由来NO還元酵素の基質結合型無損傷X線結晶構造解析 (2015)
  • Author(s): 西田拓真，當舎武彦，杉本宏，木村哲就，平田邦夫，上野剛，吾郷日出夫，山本雅貴，城宜嗣，久保稔
  • Organizer: 平成27年度日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 大阪府立大学（大阪府堺市）
  • Year and Date: 2015-10-17
• [Presentation] Development of on-axis simultaneous measurement system of UV-visible absorption with X-ray diffraction at SPring-8 (2015)
  • Author(s): Sakaguchi, M., Kimura, T., Nishida, T., Tosha, T., Yanagisawa, S., Ueno, G., Murakami, H., Ago, H., Yamamoto, M., Ogura, T., Shiro, Y., ○Kubo, M.
  • Organizer: 12th International Conference on Synchrotron Radiation Instrumentation (SRI 2015)
  • Place of Presentation: Marriott Marquis Times Square (New York, USA)
  • Year and Date: 2015-07-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ケージドNOを用いた脱窒カビ由来NO還元酵素結晶における反応中間体の調製 (2015)
  • Author(s): 西田拓真，當舎武彦，坂口美幸，木村哲就，柳澤幸子，上野剛，村上博則，山本雅貴，小倉尚志，城宜嗣，久保稔
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-25
• [Presentation] Damage-free X-ray crystallographic analysis of P450nor in the NO bound form using SACLA (2015)
  • Author(s): Nishida, T., Tosha, T., Sugimoto, H., Kimura, T., Hirata, K., Ueno, G., Ago, H., Yamamoto, M., Shiro, Y., Kubo, M.
  • Organizer: Metals in Biology in Wako
  • Place of Presentation: 理化学研究所・和光（埼玉県和光市）
  • Year and Date: 2015-06-16
  • Int'l Joint Research