タンパク質間相互作用解析とイメージングに基づく繊毛形成と繊毛内輸送機構の解明

• Project Area: Cilium-centrosome system regulating biosignal flows
• Project/Area Number: 15H01211
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科, 教授 (40192679)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥10,920,000 (Direct Cost: ¥8,400,000、Indirect Cost: ¥2,520,000); Fiscal Year 2016: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000); Fiscal Year 2015: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
• Keywords: 細胞・組織 / シグナル伝達 / 繊毛 / タンパク質間相互作用 / タンパク質輸送

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、繊毛内タンパク質輸送に関与するIFT-A複合体とIFT-B複合体、これらの複合体に結合するタンパク質の輸送や機能について解析した。
１．独自に開発した『観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法（VIPアッセイ）』を活用して、繊毛内の逆行性タンパク質輸送に関与するIFT-A複合体（7サブユニットからなる）の構築様式を解明した。さらに、独自に改良したCRISPR/Cas9ゲノム編集法により作製したIFT-A複合体のサブユニットのノックアウト（KO）細胞を用いた解析によって、IFT-A複合体が従来から言われている繊毛内逆行輸送だけでなく、GPCRなどのタンパク質の繊毛内への進入にも関与することを初めて明らかにした。
２．繊毛病ジュベール症候群の原因遺伝子産物である低分子量GTPのARL13Bが順行性タンパク質輸送に関与するIFT-B複合体（16サブユニットからなる）に、IFT46-IFT56二量体を介して結合することを明らかにした。しかし、KO細胞を用いた実験によって、ARL13BはIFT-B非依存的に繊毛内へと進入し、繊毛全体に分布することを明らかにした。さらに、ARL13Bは、別のジュベール症候群原因遺伝子産物であるINPP5Eと協調して機能することを明らかにした。
３．モータータンパク質のKIF17がIFT-B複合体にIFT46-IFT56二量体を介して結合することを明らかにした。しかし、タンパク質間相互作用の実験や、KO細胞を用いた実験によって、KIF17はIFT-B複合体のモーターとして機能するのではなく、IFT-B複合体の積み荷タンパク質として、繊毛の先端へと輸送されることを明らかにした。さらに、KIF17の繊毛内への進入には核移行シグナル（NLS）も必要であり、このNLSにはインポーチン・αファミリーが結合することを明らかにした。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by the Joubert syndrome proteins ARL13B and INPP5E. (2017)
  • Author(s): Nozaki S, Katoh Y, Terada M, Michisaka S, Funabashi T, Takahashi S, Kontani K, Nakayama K.
  • Journal Title: J. Cell. Sci. Volume: 130 Issue: 3 Pages: 563-576
  • DOI: 10.1242/jcs.197004
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Intraflagellar transport-A complex mediates ciliary entry and retrograde trafficking of ciliary G protein-coupled receptors (2017)
  • Author(s): Hirano T, Katoh Y, Nakayama K
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell Volume: 28 Issue: 3 Pages: 429-439
  • DOI: 10.1091/mbc.e16-11-0813
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ciliary entry of KIF17 is dependent on its binding to the IFT-B complex via IFT46-IFT56 as well as on its nuclear localization signal (2017)
  • Author(s): Funabashi T, Katoh Y, Michisaka S, Terada M, Sugawa M, Nakayama K
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell Volume: 28 Issue: 5 Pages: 624-633
  • DOI: 10.1091/mbc.e16-09-0648
  • NAID: 120005997941
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Practical method for targeted disruption of cilia-related genes by using CRISPR/Cas9-mediated, homology-independent knock-in system (2017)
  • Author(s): Katoh Y, Michisaka S, Nozaki S, Funabashi T, Hirano T, Takei R, Nakayama K.
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell Volume: 28 Issue: 7 Pages: 898-906
  • DOI: 10.1091/mbc.e17-01-0051
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Overall architecture of the intraflagellar transport (IFT)-B complex containing Cluap1/IFT38 as an essential component of the IFT-B peripheral subcomplex. (2016)
  • Author(s): Katoh Y, Terada M, Nishijima Y, Takei R, Nozaki S, Hamada H, Nakayama K
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 291 Issue: 21 Pages: 10962-10975
  • DOI: 10.1074/jbc.m116.713883
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Modulation of primary cilia length by melanin-concentrating hormone receptor 1. Cell Signaling (2016)
  • Author(s): Hamamoto A, Yamato S, Katoh Y, Nakayama K, Yoshimura K, Takeda S, Kobayashi Y, *Saito Y
  • Journal Title: Cellular Signalling Volume: 28 Issue: 6 Pages: 272-584
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2016.02.018
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Alteration of transbilayer phospholipid compositions is involved in cell adhesion, cell spreading, and focal adhesion formation (2016)
  • Author(s): Miyano R, Matsumoto T, Takatsu H, Nakayama K, Shin HW
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 590 Issue: 14 Pages: 2138-2145
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12247
  • NAID: 120007159976
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The phospholipid flippase ATP9A is required for the recycling pathway from the endosomes to the plasma membrane (2016)
  • Author(s): Tanaka Y, Ono N, Shima T, Tanaka G, Katoh Y, Nakayama K, Takatsu H, Shin HW
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell Volume: 27 Issue: 24 Pages: 3883-3893
  • DOI: 10.1091/mbc.e16-08-0586
  • NAID: 120005997942
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Class I Arfs (Arf1 and Arf3) and Arf6 are localized to the Flemming body and play important roles in cytokinesis. (2016)
  • Author(s): Hanai, A., Ohgi, M., Yagi, C., Ueda, T., Shin, H.-W., and Nakayama, K.
  • Journal Title: Journal of Biochemistry Volume: 159 Issue: 2 Pages: 201-208
  • DOI: 10.1093/jb/mvv088
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] GM130 is a parallel tetramer with a flexible rod-like structure and N-terminally open (Y-shaped) and closed (I-shaped) conformations. (2015)
  • Author(s): Ishida R, Yamamoto A, Nakayama K, Sohda M, Misumi Y, Yasunaga T, Nakamura N.
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 印刷中 Issue: 11 Pages: 2232-2244
  • DOI: 10.1111/febs.13271
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Architectures of multisubunit complexes revealed by a visible immunoprecipitation assay using fluorescent fusion proteins. (2015)
  • Author(s): Katoh Y, Nozaki S, Hartanto D, Miyano R, Nakayama K
  • Journal Title: Journal of Cell Science Volume: 128 Issue: 12 Pages: 2351-2362
  • DOI: 10.1242/jcs.168740
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phospholipid flippase ATP10A translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2015)
  • Author(s): Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K., and Shin, H.-W.
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 290 Issue: 24 Pages: 15004-15017
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.655191
  • NAID: 120005690225
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] SNAP23/25 and VAMP2 mediate exocytic event of transferrin receptor-containing recycling vesicles. (2015)
  • Author(s): Kubo K, Kobayashi M, Nozaki S, Yagi C, Hatsuzawa K, Katoh Y, Shin HW, Takahashi S, Nakayama K
  • Journal Title: Biology Open Volume: 4 Issue: 7 Pages: 910-920
  • DOI: 10.1242/bio.012146
  • NAID: 120005997718
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] COPI-mediated retrieval of SCAP is critical for regulating lipogenesis under basal and sterol-deficient conditions. (2015)
  • Author(s): Takashima, K., Saitoh, A., Funabashi, T., Hirose, S., Yagi, C., Nozaki, S., Sato, R., Shin, H.-W., and Nakayama, K.
  • Journal Title: Journal of Cell Science Volume: 128 Pages: 2805-2815
  • DOI: 10.1242/jcs.164137
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ATP11C mutation is responsible for the defect in phosphatidylserine uptake in UPS-1 cells. (2015)
  • Author(s): Takada, N., Takatsu, H., Miyano, R., Nakayama, K., and Shin, H.-W.
  • Journal Title: Jounal of Lipid Research Volume: 56 Issue: 11 Pages: 2151-2157
  • DOI: 10.1194/jlr.m062547
  • NAID: 120005707794
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Phospholipid flippase ATP10A, a me mber of type IV P-type ATPases, translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2016)
  • Author(s): Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • Organizer: 2016 ASCB Annu al Meeting.
  • Place of Presentation: San Francisco, California, USA,
  • Year and Date: 2016-12-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by Joubert syndrome proteins Arl13b and INPP5E. (2016)
  • Author(s): Nozaki, S., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • Organizer: 2016 ASCB Annu al Meeting.
  • Place of Presentation: San Francisco, California, USA,
  • Year and Date: 2016-12-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Arl13b-dependant localization of INPP5E within cilia maintains ciliary r etrograde protein trafficking. (2016)
  • Author(s): Nozaki, S., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • Organizer: The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2016-11-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Overall architecture of the intraflagellar transport (IFT)-B complex rev ealed by a visible immunoprecipitation assay. (2016)
  • Author(s): Katoh, Y., Terada, M. & Nakayama, K.
  • Organizer: he 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Dir ections”
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2016-11-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Differential roles of KIF17 and heterotrimeric kinesin-II interacting with the IFT-B complex in biogenesis of primary cilia. (2016)
  • Author(s): Funabashi, T., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • Organizer: The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”.
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2016-11-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] IFT-A複合体と相互作用するC11orf74の繊毛内タンパク質輸送における役割． (2016)
  • Author(s): 高原万梨子、平野友章、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第89回日 本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2016-09-25
• [Presentation] キネシン2とIFT複合体の相互作用の様式の解明と繊毛形成における役割． (2016)
  • Author(s): 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第89回日 本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2016-09-25
• [Presentation] P4-ATPaseによるリン脂質フリップが膜変形に与える影響． (2016)
  • Author(s): 高田直人、中山和久、申 惠媛
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2016-09-25
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP11CのPKCによる制御機構． (2016)
  • Author(s): 高津宏之、高山真裕、中山和久、申 惠媛
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2016-09-25
• [Presentation] ジュベール症候群原因遺伝子産物Arl13bによって制御される繊毛内タンパク質輸送の分子機構． (2016)
  • Author(s): 加藤洋平、野崎梢平、中山和久
  • Organizer: 第 89回日本生化学会大会シンポジウム「Arfファミリー低分子量Gタンパク質群が介在する多彩な生理機能と関連疾患」
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2016-09-25
  • Invited
• [Presentation] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割． (2016)
  • Author(s): 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2016-09-10
• [Presentation] 繊毛内タンパク質の輸送を担うIFT-A複合体の構築様式と機能の解明． (2016)
  • Author(s): 平野友章、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2016-09-10
• [Presentation] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2-Cep19-FOPの機能の解析． (2016)
  • Author(s): 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2016-09-10
• [Presentation] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割． (2016)
  • Author(s): 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2016-06-16
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Aの構築様式と機能の解明． (2016)
  • Author(s): 平野友章、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2016-06-15
• [Presentation] KIF17とIFT複合体の相互作用様式の解明と繊毛形成における役割． (2016)
  • Author(s): 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2016-06-15
• [Presentation] 観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」を活用した繊毛内タンパク質輸送複合体 IFT-Bの構築様式の解明． (2016)
  • Author(s): 加藤洋平、寺田将也、野崎梢平
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2016-06-15
• [Presentation] Trafficking Machineries within Cilia: Arc hitectures and Functions of the IFT-A and IFT-B complexes. (2016)
  • Author(s): Nakayama, K., Katoh, Y., Terada, T., Nozaki, S., Hirano, T. & Funabashi, T.
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会シンポジウム「高次生命機能を司るメンブレ ントラフィック：分子基盤からその破綻による疾患発症の理解に向けて」
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2016-06-15
  • Invited
• [Presentation] 「観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」の開発と繊毛内タンパク質輸送複合体 IFT-B の 構築様式の解明． (2016)
  • Author(s): 加藤洋平、寺田将也、中山和久
  • Organizer: 第63回日本生化学会近畿支部例会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2016-05-21
• [Presentation] KIF17 と IFT 複合体の相互作用様式の解明と繊毛内輸送における役割． (2016)
  • Author(s): 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第63回日本生化学会近畿支部例会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2016-05-21
• [Presentation] ホスファチジルセリン取り込み異常のCHO-K1変異株（UPS-1）におけるflippaseの発現解析． (2015)
  • Author(s): 高田直人、高津宏之、宮野吏永、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式とCLUAP1の機能の解明． (2015)
  • Author(s): 寺田将也、加藤洋平、野崎梢平、武井領汰、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2とCep19の機能の解析． (2015)
  • Author(s): 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体から小胞体への逆行輸送による脂質代謝の調節． (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申惠媛、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] Visible immunoprecipitation（VIP）アッセイによるExocyst複合体の構築様式の解明． (2015)
  • Author(s): 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体-小胞体間の逆行輸送による脂質代謝調節． (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申 惠媛、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性および細胞膜ダイナ ミクスへの関与． (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申 惠媛
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12
• [Presentation] Architectures of the BBSome, IFT-B, and Exocyst Complexes Revealed by Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay Using Fluorescent Fusion Proteins. (2015)
  • Author(s): Nakayama, K., Katoh, Y., Nozaki, S., & Terada, M.
  • Organizer: FASEB Science Research Conference, “Biology o f Cilia and Flagella”
  • Place of Presentation: Snowmass Village, Colorado,
  • Year and Date: 2015-07-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Visible immunoprecipitation (VIP) アッセイによるマルチサブユニット複合体の構築様式の解明 (2015)
  • Author(s): 加藤洋平、野崎梢平、寺田将也、中山和久
  • Organizer: 第67回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-06-30
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性及び細胞膜ダイナミクスへの関与． (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第62回日本生化学会近畿支部例会
  • Place of Presentation: 草津
  • Year and Date: 2015-05-16