遺伝子コードされたFRET型酸素バイオセンサーの開発

• Project Area: Oxygen biology: a new criterion for integrated understanding of life
• Project/Area Number: 15H01401
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2016: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2015: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: 酸素 / FRET / 抗体 / バイオセンサー / バイオテクノロジー / イメージング

Outline of Annual Research Achievements

FRET型酸素バイオセンサーを構築するためには、酸素結合タンパク質の酸素結合状態を認識する一本鎖抗体（scFv）あるいは単一ドメイン抗体（sdAb）が必要である。そこで、市販の非免疫scFvおよびsdAbのファージディスプレイライブラリーから、そのような抗体の単離を試みた。まず、磁気ビーズ上に酸素結合タンパク質FixLを固定し、抗体が提示されたファージと反応させ、結合しないファージを洗浄除去した。次に、グルコースおよびグルコースオキシダーゼを加えることで、溶液中の酸素分圧を低下させ、溶出されるファージを得た。このサイクルを３サイクル繰り返すことで１種類のscFvのファージクローンが濃縮される事を見出した。しかし、この得られたscFvクローンとFixLタンパク質の間に酸素依存的な相互作用を確認することはできなかった。そこで、現在は以下の検討をおこなっている。(1) FixLで免疫をおこなったマウスからscFvのファージディスプレイライブラリーを作成する。これによって、FixLを認識するクローンを多数含むライブラリーが構築できると期待される。(2) mRNAライブラリーなどファージディスプレイ以外のライブラリーを用いる。近年、この手法は大幅に改良されており、抗体だけではなく、人工的な結合タンパク質のスクリーニングにも利用されている。こうした手法を取り入れることで、早期に酸素依存的にFixLに結合するタンパク質を得ることを目指す。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Mitochondrial dysfunction induces dendritic loss via eIF2α phosphorylation. (2017)
  • Author(s): Taiichi Tsuyama, Asako Tsubouch, Tadao Usui, Hiromi Imamura, and Tadashi Uemura.
  • Journal Title: The Journal of Cell Biology Volume: 216(3) Issue: 3 Pages: 815-834
  • DOI: 10.1083/jcb.201604065
  • NAID: 120006360787
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Application of FRET-Based Biosensor "ATeam" for Visualization of ATP Levels in the Mitochondrial Matrix of Living Mammalian Cells. (2017)
  • Author(s): Yoshida T, Alfaqaan S, Sasaoka N, Imamura H
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 1567 Pages: 231-243
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-6824-4_14
  • ISBN: 9781493968220, 9781493968244
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] BTeam, a Novel BRET-based Biosensor for the Accurate Quantification of ATP Concentration within Living Cells. (2016)
  • Author(s): Yoshida T, Kakizuka A, Imamura H.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Issue: 1 Pages: 39618-39618
  • DOI: 10.1038/srep39618
  • NAID: 120005947215
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] sNOOOpy, a Sensor for Physiological NO3－/NO2－ Employing a Bacterial Two-Component Regulatory System. (2016)
  • Author(s): Hidaka M, Gotoh A, Shimizu T, Minamisawa K, Imamura H and Uchida T
  • Journal Title: Journal Biological Chemistry Volume: 291 Issue: 5 Pages: 2260-2269
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.687632
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Glycolysis, but not Mitochondria, responsible for intracellular ATP distribution in cortical area of podocytes (2015)
  • Author(s): Ozawa S., Ueda S., Imamura H., Mori K., Asanuma K., Yanagita M., Nakagawa T.
  • Journal Title: Scientific Rep Volume: 5 Issue: 1 Pages: 18575-18575
  • DOI: 10.1038/srep18575
  • NAID: 130007901070
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mild glucose starvation induces KDM2A-mediated H3K36me2 demethylation through AMPK to reduce rRNA transcription and cell proliferation (2015)
  • Author(s): Tanaka Y, Yano H, Ogasawara S, Yoshioka SI, Imamura H, Okamoto K, Tsuneoka M
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell. Volume: 35 Issue: 24 Pages: 4170-4184
  • DOI: 10.1128/mcb.00579-15
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Associative interactions in crowded solutions of biopolymers counteract depletion effects (2015)
  • Author(s): Groen J, Foschepoth D, Te Brinke E, Boersma AJ, Imamura H, Rivas G, Heus HA, Huck WT
  • Journal Title: J. Am. Chem. Soc Volume: 137 Issue: 40 Pages: 13041-13048
  • DOI: 10.1021/jacs.5b07898
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The plasma membrane calcium pump in pancreatic cancer cells exhibiting the Warburg effect relies on glycolytic ATP (2015)
  • Author(s): James AD, Patel W, Butt Z, Adiamah M, Dakhel R, Latif A, Uggenti C, Swanton E, Imamura H, Siriwardena AK, Bruce JI
  • Journal Title: J. Bio. Chem. Volume: 290 Issue: 41 Pages: 24760-24771
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.668707
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] アポトーシスにおける細胞内ATPダイナミクスのイメージング (2017)
  • Author(s): 今村博臣
  • Organizer: 第94回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: アクトシティ浜松
  • Year and Date: 2017-03-29
  • Invited
• [Presentation] 分岐鎖アミノ酸に対するFRET型蛍光バイオセンサーの開発 (2017)
  • Author(s): 高橋世菜、垣塚彰、今村博臣
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学
  • Year and Date: 2017-03-19
• [Presentation] 蛍光バイオセンサーを用いた生細胞内可視化技術 (2017)
  • Author(s): 今村博臣
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学
  • Year and Date: 2017-03-18
  • Invited
• [Presentation] 新規発光型ATPバイオセンサーの開発 (2016)
  • Author(s): 吉田有希、今村博臣
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会 第42回討論会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学
  • Year and Date: 2016-12-19
• [Presentation] ATP imaging revealed a mechanism of intracellular ATP changes during apoptosis (2016)
  • Author(s): 今村博臣
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場
  • Year and Date: 2016-11-27
• [Presentation] Molecular mechanism underlying intracellular ATP changes during apoptosis (2016)
  • Author(s): Imamura H, Sakamoto S, Yoshida T, Kakizuka A
  • Organizer: European Bioenergetics Conference 2016
  • Place of Presentation: Riva del Garda, Italy
  • Year and Date: 2016-07-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of a new BRET-based ATP indicator for quantitative intracellular ATP assay (2016)
  • Author(s): Yoshida T, Kakizuka A, Imamura H
  • Organizer: European Bioenergetics Conference 2016
  • Place of Presentation: Riva del Garda, Italy
  • Year and Date: 2016-07-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生細胞ATPイメージングから酸素とATPの関係を探る (2016)
  • Author(s): 今村博臣
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2016-06-07
  • Invited
• [Presentation] 細胞外ATPの定量的蛍光イメージングを目指したバイオセンサーの開発 (2015)
  • Author(s): 西山翠、岩切竜太、垣塚彰、今村博臣
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] 腎臓糸球体構成細胞ポドサイト細胞における、ATP産生に着目した解糖系とミトコンドリアの異なる役割 (2015)
  • Author(s): 小沢将太、上田修子、今村博臣、森潔、浅沼克彦、柳田素子、仲川孝彦
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] ミトコンドリアA3243G変異患者から樹立した疾患特異的iPS細胞の機能解析 (2015)
  • Author(s): 松原正樹、神田一、今村博臣、井上真由美、野口倫夫、細田公則、垣塚彰、中尾一和
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] 生細胞内ATP濃度のダイナミクス・分布・多様性 (2015)
  • Author(s): 今村博臣
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-01
  • Invited
• [Presentation] ホスファチジルセリンに対するFRET型蛍光バイオセンサーの開発 (2015)
  • Author(s): 西谷勇人、今村博臣、垣塚彰
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] パーキンソン病モデルにおけるATP制御による予防法の確立 (2015)
  • Author(s): 中野将希、首藤敏之、今村博臣、垣塚彰
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] 麻酔効果と細胞内ATPレベルの関連性 (2015)
  • Author(s): 井上勇奎、岸川淳一、中西温子、船越勇殻、西村健司、藤川誠、今村博臣、横山謙
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] ATP metabolism in Xenopus laevis: Is ATP yielded by glycolysis during maturation? (2015)
  • Author(s): 井尻貴之、岸川淳一、今村博臣、峰家真穂、上野秀一、岩尾康宏、横山謙、佐藤賢一
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会・第８８回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] パーキンソン病モデルにおけるATP制御による予防法の確立に向けて (2015)
  • Author(s): 中野将希、首藤敏之、今村博臣、垣塚彰
  • Organizer: 第１５回日本ミトコンドリア学会年会
  • Place of Presentation: 福井県国際交流会館
  • Year and Date: 2015-11-20
• [Presentation] Improvement of binding speed and photostability of fluorescent ATP biosensor for extracellular ATP imaging (2015)
  • Author(s): Imamura H, Nishiyama S, Iwakiri R, Kakizuka A
  • Organizer: 第５３回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学
  • Year and Date: 2015-09-14
• [Presentation] Development of a new BRET based ATP indicator for high-throughput quantitative ATP assay (2015)
  • Author(s): Yoshida T, Imamura H
  • Organizer: 第５３回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学
  • Year and Date: 2015-09-13