立体構造から理解するRNAタクソノミ

• Project Area: Neo-taxonomy of noncoding RNAs
• Project/Area Number: 15H01463
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 西増 弘志 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (00467044)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000); Fiscal Year 2016: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2015: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: 結晶構造

Outline of Annual Research Achievements

II型CRISPR-Cas系にかかわるRNA依存性エンドヌクレアーゼCas9は、ガイドRNA（crRNAとtracrRNA）と複合体を形成し標的二本鎖DNAを切断する。近年、Cas9を利用した新規技術が開発され幅広い研究分野において利用されている。本研究では、最小のCas9のひとつであるCampylobacter jejuni由来Cas9（CjCas9）の結晶構造をガイドRNAおよび標的DNAとの複合体として決定した。結晶構造から、CjCas9のガイドRNAは三重らせんを含む予想外の構造をもつことが明らかになった。さらに、既知のCas9は非相補鎖の塩基をPAMとして認識するのに対し、CjCas9は相補鎖および非相補鎖の両方の塩基と相互作用することによりNNNVRYM配列をPAMとして認識していた。今回の結果は、CRISPR-Cas9の多様性を明らかにするとともに新たなゲノム編集ツールの開発基盤となることが期待される。V型CRISPR-Cas系にかかわるRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼCpf1（Cas12a）が発見され、新たなゲノム編集ツールとして注目されている。Cpf1はCas9と異なり、TリッチなPAMを認識し、標的となる二本鎖DNAを切断し突出末端を形成する。本研究では、Cpf1の作動機構の解明をめざし、Cpf1-crRNA-標的二本鎖DNA複合体の結晶構造を決定した。結晶構造から、Cpf1は2つのローブからなる新規の構造をもつことが明らかになった。crRNAはステムループ構造をもつことが予想されていたが、シュードノット構造をもち、Cpf1によって認識されていた。さらに、連続したT塩基を含むPAM二本鎖は配列・構造特異的に認識されていた。さらに、Cpf1とCas9の構造比較から、これら2つのCRISPR-Casヌクレアーゼにおける共通性および多様性が明らかになった。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Broad Institute/NIH(米国)
• [Int'l Joint Research] Broad Institute of MIT and Harvard(米国)
• [Journal Article] Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA (2016)
  • Author(s): Yamano T, Nishimasu H, Zetsche B, Hirano H, Slaymaker IM, Li Y, Fedorova I, Nakane T, Makarova KS, Koonin EV, Ishitani R, Zhang F, Nureki O
  • Journal Title: Cell Volume: 165 Issue: 4 Pages: 946-962
  • DOI: 10.1016/j.cell.2016.04.003
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystal structure of silkworm PIWI-clade Argonaute Siwi bound to piRNA (2016)
  • Author(s): Matsumoto N, Nishimasu H, Sakakibara K, Nishida KM, Hirano T, Ishitani R, Siomi H, Siomi MC, Nureki O
  • Journal Title: Cell Volume: 167 Issue: 2 Pages: 484-497
  • DOI: 10.1016/j.cell.2016.09.002
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystal Structure of the Minimal Cas9 from Campylobacter jejuni Reveals the Molecular Diversity in the CRISPR-Cas9 Systems (2016)
  • Author(s): Yamada M, Watanabe Y, Gootenberg JS, Hirano H, Ran FA, Nakane T, Ishitani R, Zhang F, Nishimasu H, Nureki O
  • Journal Title: Mol Cell Volume: 65 Issue: 6 Pages: 1109-1121
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2017.02.007
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9 (2016)
  • Author(s): Hisato Hirano, Jonathan S. Gootenberg, Takuro Horii, Omar O. Abudayyeh, Mika Kimura, Takanori Nakane, Ryuichiro Ishitani, Izuho Hatada, Feng Zhang, Hiroshi Nishimasu, Osamu Nureki
  • Journal Title: Cell Volume: 164 Issue: 5 Pages: 950-961
  • DOI: 10.1016/j.cell.2016.01.039
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural Basis for the Altered PAM Specificities of Engineered CRISPR-Cas9 (2016)
  • Author(s): Seiichi Hirano, Hiroshi Nishimasu, Ryuichiro Ishitani, Osamu Nureki
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 61 Issue: 6 Pages: 886-894
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2016.02.018
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9 (2015)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu, Le Cong, Winston X. Yan, F. Ann Ran, Bernd Zetsche, Yinqing Li, Arisa Kurabayashi, Ryuichiro Ishitani, Feng Zhang, Osamu Nureki
  • Journal Title: Cell Volume: 162 Issue: 5 Pages: 1113-1126
  • DOI: 10.1016/j.cell.2015.08.007
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] CRISPR-Cas9の機能と構造 (2016)
  • Author(s): 西増弘志
  • Organizer: 第17回極限環境生物学会
  • Place of Presentation: 東京工業大学すずかけ台キャンパス（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-25
  • Invited
• [Presentation] CRISPR-Cas9およびCRIPSR-Cpf1の結晶構造 (2016)
  • Author(s): 西増弘志、山野 峻、平野央人、石谷隆一郎、濡木理
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-25
  • Invited
• [Presentation] Crystal structure of silkworm PIWI, Siwi, in complex with piRNA (2016)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu, Naoki Matsumoto, Kazuhiro Sakakibara, Kazumichi Nishida, Ryuichiro Ishitani, Haruhiko Siomi, Mikiko C. Siomi, Osamu Nureki
  • Organizer: RNA2016
  • Place of Presentation: 京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-06-28
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 小型CRISPR-Cas9の結晶構造 (2015)
  • Author(s): 西増弘志、石谷隆一郎、濡木 理
  • Organizer: BMB2015
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] CRISPR-Cas9の結晶構造 (2015)
  • Author(s): 西増弘志
  • Organizer: 第53回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-15
  • Invited
• [Remarks] ゲノム編集のための「小さなはさみ」のかたち
  • URL: http://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2015/36.html
• [Remarks] ゲノム編集のための新たな「はさみ」-立体構造にもとづくCRISPR-Cas9の改変-
  • URL: https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2016/4599/