非コードRNAとの結合を介したMediator複合体による転写制御機構の解明

• Project Area: Neo-taxonomy of noncoding RNAs
• Project/Area Number: 15H01471
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 河原 行郎 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80542563)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000); Fiscal Year 2016: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2015: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: 転写 / 非コードRNA / 精神遅滞 / 子宮筋腫 / RNA代謝

Outline of Annual Research Achievements

Mediatorの転写時における役割を明らかにするため、昨年度に引き続き、サブユニットに結合するRNAの同定を試みた。MED13およびMED13LにPIWIモジュールがあることから、これら二つを標的タンパク質としてPAR-CLIP法を実施した。その結果、内在タンパク質を標的とした手法は、よい市販の抗体が得られず断念したが、Haloタグを付加したものではライブラリーの作成に成功した。特にMED13Lに結合するRNAが強く検出された。これをNGSによるシーケンス解析した結果、結合RNAの主要なものはtRNAであり、他にも細胞質中にあるRNAが大多数を占めていた。MED13を含めたMediator複合体は通常は核に局在していることから、細胞質中でtRNAと結合している意義については現在解析中である。一方、通常のPAR-CLIP法のプロトコールでは、核内でクロマチンと結合したRNAおよびMediator複合体を回収できていない可能性が考えられた。このため、核膜を完全に溶解する改変法を確立すべく条件検討を重ねた。その結果、細胞溶解液の塩濃度を高くすると、PAR-CLIP法で回収できるRNA量が格段に増えることを見出した。このため、この改変プロトコールでMED13Lに対してPAR-CLIPを行い、NGSでシーケンス解析を行った。現在、その性状について解析中であるが、主要なものはncRNAおよびlong ncRNAとなったことから、核内の結合RNAを回収できたものと考えている。今後その内容から生理的意義について予測をたて、実際に検証する実験を行う予定である。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] CAPS1 RNA Editing Promotes Dense Core Vesicle Exocytosis. (2016)
  • Author(s): Miyake K, Ohta T, Nakayama H, Doe N, Terao Y, Oiki E, Nagatomo I, Yamashita Y, Abe T, Nishikura K, Kumanogoh A, Hashimoto K, Kawahara Y.
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 17 Issue: 8 Pages: 2004-2014
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2016.10.073
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] CLIP法とその改良法によるタンパク質結合RNAの高解像度解析 (2016)
  • Author(s): 河原行郎
  • Journal Title: 実験医学(別冊) Volume: 1 Pages: 149-158
• [Journal Article] 自己免疫疾患とRNA編集 (2015)
  • Author(s): 三宅浩太郎, 中濱泰祐, 河原行郎
  • Journal Title: 実験医学(増刊) Volume: 33(20) Pages: 3339-3344
• [Journal Article] 神経疾患をmicroRNAで診断する (2015)
  • Author(s): 河原行郎
  • Journal Title: Clinical Neuroscience Volume: 33(11) Pages: 1302-1304
• [Journal Article] マイクロRNA (2015)
  • Author(s): 余越萌, 河原行郎
  • Journal Title: 生体の科学 Volume: 66(5) Pages: 478-479
• [Presentation] CAPS1 RNA Editing Promotes Dense Core Vesicle Exocytosis. (2017)
  • Author(s): Miyake K, Ohta T, Nakayama H, Doe N, Terao Y, Oiki E, Nagatomo I, Yamashita Y, Abe T, Nishikura K, Kumanogoh A, Hashimoto K, Kawahara Y.
  • Organizer: Gordon Research Conference on RNA editing
  • Place of Presentation: Ventura, CA, USA
  • Year and Date: 2017-03-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] RNA editing-mediated prevention of activating MDA5 pathway is required for early T cell development (2017)
  • Author(s): Nakahama T, Walkley C, Kawahara Y.
  • Organizer: Gordon Research Conference on RNA editing
  • Place of Presentation: Ventura, CA, USA
  • Year and Date: 2017-03-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] RNA editing-mediated prevention of activating MDA5 pathway is required for early T cell development (2016)
  • Author(s): Nakahama T, Walkley C, Kawahara Y.
  • Organizer: 第４５回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄
  • Year and Date: 2016-12-05
• [Presentation] CAPS1 RNA Editing Promotes Dense Core Vesicle Exocytosis. (2016)
  • Author(s): 河原 行郎
  • Organizer: 第３９回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2016-11-30
  • Invited
• [Remarks] 大阪大学大学院医学系研究科神経遺伝子学教室
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/rna/publications.html