ピコルナウイルスの２Ａペプチドの終止コドン非依存的翻訳終結の構造基盤

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 15H01548
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 伊藤 拓宏 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, ユニットリーダー (70401164)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000); Fiscal Year 2016: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2015: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
• Keywords: ウイルス / 生体分子 / 電子顕微鏡 / 翻訳 / ２Aペプチド / ２Ａペプチド

Outline of Annual Research Achievements

リボソームを一時停止させた後に、N末端側にPAタグ配列を付加しておくことにより、抗PA抗体樹脂を用いて、FLAG配列の場合と同様に、停止したリボソームを選び出して精製することが可能であることを見出した。リボソームを一時停止させるために精製したヒト由来因子によって再構成した試験管内翻訳システムを用いるが、その大量反応の系を構築した。リボソームの60Sおよび40Sサブユニット、翻訳開始因子eIF3、eIF2、翻訳伸長因子eEF2、tRNAミックスについては大量に培養したHeLa細胞から効率よく精製する系を構築した。また、eIF2BやeEF1、DHX29、アミノアシルtRNA合成酵素群などについては、FreeStyle 293-Fを用いた培養システムにより大量に効率よく精製する系を構築した。eIF1やeIF1Aなどの因子については大腸菌を用いて大量に精製した。この試験管内翻訳システムの大量反応とPAタグを用いて精製したリボソームを用いてcryoEMによる単粒子解析を行い、グローバルマップとして４Åを切る分解能で構造解析が可能であることを見出した。開始粒子数を増やせば４Åを切る最終構造を算出することが可能であることが示された。
ピコルナウイルスの２Aペプチド1位のグリシンまで合成した状態で、－1位のプロリンにペプチド転移反応を起こさずにリボソームを一時停止させる手法として、tRNA(Gly)の2'にOHではなくNHにグリシンが結合している分子の合成を開始した。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Three-dimensional Structure of eIF2B: A Clue to Understanding the Pathogenesis of CACH/VWM Disease (2017)
  • Author(s): 柏木 一宏
  • Journal Title: BRAIN and NERVE Volume: 69 Issue: 1 Pages: 45-50
  • DOI: 10.11477/mf.1416200635
  • ISSN: 1344-8129, 1881-6096
  • Year and Date: 2017-01-01
• [Journal Article] Solution structure of the first RNA recognition motif domain of human spliceosomal protein SF3b49 and its mode of interaction with a SF3b145 fragment (2017)
  • Author(s): Kuwasako, K.
  • Journal Title: Protein Science Volume: 26 Issue: 2 Pages: 280-290
  • DOI: 10.1002/pro.3080
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Trm5 and TrmD: two enzymes from distinct origins catalyze the identical tRNA modification, m1G37 (2017)
  • Author(s): Goto-Ito, S.
  • Journal Title: Biomolecules Volume: 7 Issue: 1 Pages: 32-32
  • DOI: 10.3390/biom7010032
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Crystal structure of eIF2B and insights into eIF2-eIF2B interactions (2017)
  • Author(s): Kashiwagi, K.
  • Journal Title: FEBS Journal Volume: 284 Issue: 6 Pages: 868-874
  • DOI: 10.1111/febs.13896
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Methyl transfer by substrate signaling from a knotted protein fold (2016)
  • Author(s): Christian, T.
  • Journal Title: Nature Structural and Molecular Biology Volume: 23 Issue: 10 Pages: 941-948
  • DOI: 10.1038/nsmb.3282
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Expression, purification, and crystallization of Schizosaccharomyces pombe eIF2B (2016)
  • Author(s): Kazuhiro Kashiwagi, Tomoaki Shigeta, Hiroaki Imataka, Takuhiro Ito, Shigeyuki Yokoyama
  • Journal Title: Journal of Structural and Functional Genomics Volume: 17 Issue: 1 Pages: 33-38
  • DOI: 10.1007/s10969-016-9203-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Crystal structure of eukaryotic translation initiation factor 2B (2016)
  • Author(s): Kazuhiro Kashiwagi, Mari Takahashi, Madoka Nishimoto, Takuya B. Hiyama, Toshiaki Higo, Takashi Umehara, Kensaku Sakamoto, Takuhiro Ito, Shigeyuki Yokoyama
  • Journal Title: Nature Volume: 531 Issue: 7592 Pages: 122-125
  • DOI: 10.1038/nature16991
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Basis for methyl-donor-dependent and sequence-specific binding to tRNA substrates by knotted methyltransferase TrmD (2015)
  • Author(s): Takuhiro Ito, Isao Masuda, Ken-ichi Yoshida, Sakurako Goto-Ito, Shun-ichi Sekine, Se Won Suh, Ya-Ming Hou, Shigeyuki Yokoyama
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Volume: 112 Issue: 31 Pages: 4197-205
  • DOI: 10.1073/pnas.1422981112
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Crystal structure of eukaryotic translation initiation factor 2B (eIF2B) (2016)
  • Author(s): Kazuhiro Kashiwagi
  • Organizer: The RNA Society / The RNA Society of Japan
  • Place of Presentation: 京都国際会議場(京都)
  • Year and Date: 2016-09-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Crystal sturucture of eukaryotic translation initiation factor 2B (2016)
  • Author(s): Takuhiro Ito
  • Organizer: Nascent Chain Biology Meeting 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨）
  • Year and Date: 2016-09-01
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 翻訳開始因子 eIF2B の結晶構造 (2016)
  • Author(s): 柏木 一宏
  • Organizer: 日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡）
  • Year and Date: 2016-06-08
• [Presentation] tRNA(m1G37)メチル基転移酵素TrmDの基質認識機構 (2015)
  • Author(s): 伊藤拓宏
  • Organizer: BMB 2015
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2015-12-04
• [Remarks] 研究室紹介ホームページ
  • URL: http://www.clst.riken.jp/ja/science/labs/ssb/struc/tfsb/
• [Remarks] 研究室紹介ホームページ
  • URL: http://www.riken.jp/research/labs/clst/struct_synth_biol/struct_biol/transl_fact_struct_biol/