リシール細胞技術を用いた複数タンパク質の細胞内導入法とその局在化法の開発

• Project Area: Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
• Project/Area Number: 15H01631
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 村田 昌之 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (50212254)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥10,400,000 (Direct Cost: ¥8,000,000、Indirect Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2016: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2015: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
• Keywords: セミインタクト細胞リシール技術 / 細胞内導入法 / オルガネラ / 可視化 / バイオテクノロジー / 蛋白質 / 細胞･組織 / 組織･細胞

Outline of Annual Research Achievements

われわれは、細胞膜を透過性にして細胞質交換を可能にした「セミインタクト細胞リシール技術」を開発し、細胞内への生体物質導入法や導入した物質の様々な細胞内生命現象への影響などを光学顕微鏡下で可視化解析するシステムを構築している。この細胞内操作システムは、多種類のタンパク質成分や膜不透過性の(天然)化合物を、同時に定量的に細胞内に導入することが可能であり、かつオルガネラや細胞骨格の構造とトポロジーが保持されているため、導入されたタンパク質(群)の様々な動的平衡状態を「真の細胞環境内に近い状態で」計測できる。昨年度までに、in cell NMR測定に必要と思われる浮遊状態の細胞(基質からトリプシン処理により遊離させたHeLa細胞、T細胞系の株化細胞や個体から調製した血球系細胞など)をターゲットにしたリシール細胞法の基本プロトコルを作成した。今年度は、その基本プロトコルをさらに進化させ、(１)リシール操作後の細胞のviabilityや生存率の向上を目指す条件検討を行った。その結果、リシール効率及び生存率を飛躍的に増加させる化合物を数種類発見した。当該化合物の作用機序を解明することで，リシール操作に必要な細胞質成分の探索系を構築した。この他、(２)解析対象となるタンパク質や生体分子を導入したリシール細胞に、後から膜不透過性の中分子を、簡単にしかもリシール細胞にダメージを与えない状態で導入する新規の中分子導入法法を開発した。(３)これら膜不透過性中分子の細胞内での機能解析を生化学的手法または光学顕微鏡下の単一細胞レベルで定量的に解析する基本解析プロトコルを構築した。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Yip1A, a novel host factor required for the intracellular replication of Brucella abortus (2016)
  • Author(s): 田口由起、加納ふみ、村田昌之
  • Journal Title: 生化学 Volume: 88 Issue: 1 Pages: 139-143
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2016.880139
  • NAID: 40020753666
  • ISSN: 0037-1017
  • Year and Date: 2016-02-25
• [Journal Article] Reconstitution of the targeting of Rab6A to the Golgi apparatus in semi-intact HeLa cells: A role of BICD2 in stabilizing Rab6A on Golgi membranes and a concerted role of Rab6A/BICD2 interactions in Golgi-to-ER retrograde transport (2015)
  • Author(s): Matsuto, M., Kano, F., Murata, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Acta (Molecular Cell Research) Volume: 1853 Issue: 10 Pages: 2592-2609
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2015.05.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Yip1A, a Novel Host Factor for the Activation of the IRE1 Pathway of the Unfolded Protein Response during Brucella infection (2015)
  • Author(s): Taguchi, Y., Imaoka, K., Kataoka, M., Uda, A., Nakatsu, D., Horii-Okazaki, S., Kunishige, R., Kano, F., Murata, M.
  • Journal Title: PLOS Pathogens Volume: - Issue: 3 Pages: e1004747-e1004747
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1004747
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] L-cysteine reversibly inhibits glucose-induced biphasic insulin secretion and ATP production by inactivating PKM2 (2015)
  • Author(s): Nakatsu, D., Horiuchi, Y., Kano, F., Noguchi, Y., Sugawara, T., Takamoto, I., Kubota, N., Kadowaki, T., Murata, M.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: - Issue: 10
  • DOI: 10.1073/pnas.1417197112
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Translocation of FOXO1 to the nuclear periphery induces histone modifications that regulates transcriptional repression of PCK1 in HepG2 cells (2015)
  • Author(s): Arai, T., Kano, F., Murata, M.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 20 Issue: 4 Pages: 340-357
  • DOI: 10.1111/gtc.12226
  • Peer Reviewed
• [Presentation] セミインタクト細胞リシール法による病態モデル細胞構築 (2016)
  • Author(s): 村田昌之、加納ふみ
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会9.0
  • Place of Presentation: 早稲田大学国際会議場井深大記念ホール(東京都新宿区）
  • Year and Date: 2016-11-21
  • Invited
• [Presentation] L-システインによるPKM2タンパク質不活性化を介した可逆的なインスリン分泌抑制：制御機構の生理学的解析 (2015)
  • Author(s): 堀内雄太、中津大貴、加納ふみ、野口誉之、菅原太一、高本偉碩、窪田直人、門脇孝、村田昌之
  • Organizer: 第６７回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • Year and Date: 2015-06-30
• [Presentation] L-システインによるPKM2タンパク質不活性化を介した可逆的なインスリン分泌抑制：制御機構の生化学的解析 (2015)
  • Author(s): 中津大貴、堀内雄太、加納ふみ、野口誉之、菅原太一、高本偉碩、窪田直人、門脇孝、村田昌之
  • Organizer: 第６７回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • Year and Date: 2015-06-30
• [Presentation] MIN6細胞における新規ERGICとRab2Aの機能解析 (2015)
  • Author(s): 菅原太一、加納ふみ、村田昌之
  • Organizer: 第６７回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • Year and Date: 2015-06-30
• [Presentation] Yip1AはBrucella abortus感染下での小胞体ストレス応答のIRE1経路の活性化に必要な新規宿主因子である (2015)
  • Author(s): 田口由起、今岡浩一、片岡紀代、宇田晶彦、中津大貴、堀井咲耶、國重莉奈、加納ふみ、村田昌之
  • Organizer: 第６７回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • Year and Date: 2015-06-30
• [Patent(Industrial Property Rights)] 導入剤、キット、物質導入方法、及びスクリーニング (2016)
  • Inventor(s): 村田昌之、加納ふみ，村上真隆
  • Industrial Property Rights Holder: 村田昌之、加納ふみ，村上真隆
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2016-141219
  • Filing Date: 2016-07-09
• [Patent(Industrial Property Rights)] セミインタクト細胞リシール技術を利用したCRISPR-Cas9システムの機能改良・評価法の開発 (2016)
  • Inventor(s): 村田昌之、加納ふみ、村上真隆
  • Industrial Property Rights Holder: 東京大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2016-01-29
  • Overseas