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蛋白質ダイナミクスのin-cell NMR解析

Publicly Offered Research

Project AreaNovel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
Project/Area Number 15H01636
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Complex systems
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

杤尾 豪人  京都大学, 理学研究科, 教授 (70336593)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2016)
Budget Amount *help
¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000)
Fiscal Year 2016: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2015: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
KeywordsNMR / 酸化還元電位 / ジスルフィド結合 / 蛋白質 / 構造解析
Outline of Annual Research Achievements

蛋白質中のジスルフィド(SS)結合の安定性(酸化還元電位)は、SS結合の溶媒露出度に加えてシステイン残基周囲の構造揺らぎに依存する。また、環境の還元電位やpHに依存するため、細胞の状態によってダイナミックに変動する。一般に、細胞内の還元電位はグルタチオンの濃度で決まるとされるが、活性酸素種の影響も受ける。加えて、細胞内環境自体が蛋白質の構造や揺らぎに影響を及ぼすことから、細胞内におけるSS結合の状態は試験管内の知見から簡単には予測できない。本課題では、NMRを利用して、細胞内でSS結合がどの程度還元され、SH型になっているかを調べ、細胞状態や蛋白質機能との関連を調べる方法の構築を目指し、モデル蛋白として、Csk SH2ドメインを用い、これを電気穿孔法で細胞に導入しNMR測定を行うことを試みた。昨年度までに、15N標識したSH2試料の調製方法の確立は完了していたが、電気穿孔法によって細胞に導入できるSH2ドメインの量が不十分であったため、今年度も引き続きその検討を行った。SH2の代わりに、蛍光を使った検出が容易なGFPを用いて、電気パルスの長さやタイミング、印加電圧を様々に変えて電気穿孔を行ない、GPFの導入効率を検討した。さらに、GFPが最も効率良く導入できた条件の近傍で、SH2の導入条件の検討を行った。これにより、SH2ドメインのNMRスペクトル(2D 1H-15N HMQC)を得ることに成功した。しかし、定量的な解析を行うにはNMR信号の強度が十分ではなく、細胞内でSS結合が還元されていく速度や、還元電位を精確に求めるには至らなかった。アミド水素のスピン緩和時間を長くするために、それら以外を重水素化した試料を用いるなど、さらなる検討が必要であると考えられた。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2016 Annual Research Report
  • 2015 Annual Research Report
  • Research Products

    (5 results)

All 2016 2015

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] ナノダイヤモンドNVCを使った新しい生体・細胞計測法2016

    • Author(s)
      五十嵐龍治,杤尾豪人,白川昌宏
    • Journal Title

      光技術コンタクト

      Volume: 54 Pages: 3-11

    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Journal Article] Selective Labeling of Proteins on Living Cell Membranes Using Fluorescent Nanodiamond Probes.2016

    • Author(s)
      Shingo Sotoma, Jun Iimura, Ryuji Igarashi, Koichiro M. Hirosawa, Hidenori Ohnishi, Shin Mizukami, Kazuya Kikuchi, Takahiro K. Fujiwara, Masahiro Shirakawa and Hidehito Tochio
    • Journal Title

      Nanomaterials

      Volume: 6 Issue: 4 Pages: 56-56

    • DOI

      10.3390/nano6040056

    • NAID

      120005848250

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Stability of disulfide bonds of proteins in the cytosolic space analyzed using NMR spectroscopy2015

    • Author(s)
      杤尾 豪人
    • Organizer
      BMB2015
    • Place of Presentation
      神戸市
    • Year and Date
      2015-12-01
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Stability of disulfide bonds of proteins in the cytosolic space analyzed using NMR spectroscopy2015

    • Author(s)
      杤尾 豪人
    • Organizer
      第53回日本生物物理学会年会
    • Place of Presentation
      金沢市
    • Year and Date
      2015-09-13
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Interactions and dynamics of proteins studied by mammalian in-cell NMR2015

    • Author(s)
      杤尾 豪人
    • Organizer
      6th Asia-Pacific NMR syposium
    • Place of Presentation
      香港
    • Year and Date
      2015-08-13
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2015-04-16   Modified: 2018-03-28  

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