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過渡的に形成されるDNA結合タンパク質多量体の動的構造の蛍光1分子イメージング

Publicly Offered Research

Project AreaNovel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
Project/Area Number 15H01648
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Complex systems
Research InstitutionThe Graduate School for the Creation of New Photonics Industries

Principal Investigator

横田 浩章  光産業創成大学院大学, 光産業創成研究科, 准教授 (90415547)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2016)
Budget Amount *help
¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
Fiscal Year 2016: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2015: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Keywordsタンパク質・核酸の構造・動態・機能 / 蛍光1分子イメージング / 磁気共鳴 / ナノ計測 / 1分子計測(SMD) / ナノバイオ / 核酸 / 酵素反応
Outline of Annual Research Achievements

DNA複製・修復・組み換えは、種の遺伝的連続性を保証する最も重要な機構である。これまで、これらの機構に関与する数々のタンパク質の同定と構造解析がなされ、詳細な生化学的解析に基づいて反応機構のモデルが提唱されてきた。一方、実際これらのタンパク質が機能する多数のサブユニットからなる複合体の3次元構造やダイナミクスに迫ること困難なこともあり、様々なタンパク質分子の相互作用ダイナミクスについては不明な点が多く残されている。
そのダイナミックなプロセスの理解には、直接タンパク質が機能している現場を可視化することが鍵となると考え、これまでDNA結合タンパク質1分子を直接イメージングしてきた。大腸菌のDNA修復機構で機能する非六量体型ヘリカーゼUvrDについては、単量体ではなく二量体あるいは三量体でDNAを巻き戻していることを明らかにしている。本研究では、このヘリカーゼがDNAを巻き戻す際に形成する過渡的な多量体の動的構造を蛍光1分子イメージングで解明することを目指している。
平成28年度は、UvrDの多量体のタンパク質-タンパク質間相互作用の構造ダイナミクスとDNA巻き戻し活性の関係を探るために、UvrD間の1分子FRET観察を継続した。また、C末のアミノ酸を欠如させた変異体を発現・精製し、その間の1分子FRETも観察した。さらに、野生型のUvrDに存在する6つのシステイン残基をアラニンに置換した変異体を作製した。このシステインフリー変異体から任意の部位にシステイン残基をもつUvrDを作製することができる。また、UvrDの多量体構造の光検出磁気共鳴(ODMR)による解明に向けて、蛍光ダイヤモンドナノ粒子の表面修飾、ビオチン化UvrDの部位特異的蛍光標識、ビオチン-アビジン系を利用したUvrDの蛍光ダイヤモンドナノ粒子標識を行った。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2016 Annual Research Report
  • 2015 Annual Research Report
  • Research Products

    (6 results)

All 2016 2015

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (4 results) (of which Invited: 3 results)

  • [Journal Article] A Simple Method for Ion Channel Recordings Using Fine Gold Electrode2016

    • Author(s)
      Okuno, D., Hirano, M., Yokota, H., Onishi, Y., Ichinose, J., Ide, T.
    • Journal Title

      Analytical Sciences

      Volume: 32 Issue: 12 Pages: 1353-1357

    • DOI

      10.2116/analsci.32.1353

    • NAID

      130005433385

    • ISSN
      0910-6340, 1348-2246
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Synergistic effect of ATP for RuvA-RuvB-Holliday junction DNA complex formation.2015

    • Author(s)
      Iwasa, T., Han, Y. W., Hiramatsu, R., Yokota, H., Nakao, K., Yokokawa, R., Ono, T., Harada, Y.
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 5 Issue: 1 Pages: 18177-18177

    • DOI

      10.1038/srep18177

    • NAID

      120005712940

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] タンパク質の1 分子動態計測~1 分子直視 と1 分子顕微鏡開発~2016

    • Author(s)
      横田 浩章
    • Organizer
      第13回バイオオプティクス研究会
    • Place of Presentation
      前橋テルサ
    • Year and Date
      2016-12-02
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 大腸菌非六量体型DNAヘリカーゼUvrD多量体の1分子FRETイメージング2016

    • Author(s)
      横田 浩章
    • Organizer
      日本生物物理学会第54回年会
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場
    • Year and Date
      2016-11-25
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] 蛍光1分子イメージング技術に基づいた高精度蛍光顕微鏡法の開発2015

    • Author(s)
      横田 浩章
    • Organizer
      日本分子生物学会第38回年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド(神戸市)
    • Year and Date
      2015-12-02
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] タンパク質の1 分子動態計測~1 分子直視 と1 分子顕微鏡開発~2015

    • Author(s)
      横田 浩章
    • Organizer
      第12回バイオオプティクス研究会
    • Place of Presentation
      TKP浜松アクトタワーCC(浜松市)
    • Year and Date
      2015-11-27
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Invited

URL: 

Published: 2015-04-16   Modified: 2018-03-28  

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