生細胞深部の分子構造変化ダイナミクスをとらえる１分子ＦＲＥＴ計測法の開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
15H01654
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Complex systems
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
岡本 憲二 国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 専任研究員 (40402763)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2016)
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| Budget Amount *help |
¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2016: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2015: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | １分子計測 / FRET / 蛋白質構造 / 生細胞計測 / Raf / １分子計測(SMD) / 細胞 / 生体分子 / １分子計測 (SMD) |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コンフォーカル顕微鏡をベースとし、２基の検出器ですべてのフォトンの検出時刻を記録する TS 検出を実現した１分子FRET計測顕微鏡装置を開発した。予備実験段階ではS/N比が低く、FRETの異なる分子を識別できていなかったが、実験条件を最適化してS/N比を向上し、複数のFRETピークを分離して識別できるまでに測定精度を向上させることに成功した。またアクセプタの直接励起を可能にするレーザーを導入し、２色の励起光を高速（周期 10kHz）で切り換えることでALEX計測を実現する装置開発をおこなった。これにより、バースト毎に、FRETと蛍光ラベルの活性状態との同時検出を可能にした。２重らせんDNAの参照試料を用いたin vitro系実験で、開発した装置の検証をおこなった結果、褪色分子の影響を取り除き、FRET分布の情報だけを取り出せることを明らかにした。
開発した装置を用いて、細胞内Raf分子の１分子FRET計測をおこなった。褪色分子の影響を取り除いて細胞内Raf構造分布を得ることに成功し、その結果、少なくとも３つの構造状態が存在すること、細胞にEGF刺激が加わると５分程度で高FRETから低FRETに分布が移動し、20分程度までにほぼ元の分布に戻ること、などが明らかになった。このようなEGF刺激への過渡的な応答は、従来の知見やバルクでの細胞イメージング実験結果と整合するものである。また、分子毎の分布として捉えたことにより、EGF刺激に応答しない成分が存在することが分かった他、応答して構造変化したRafの応答前後でのFRETや、応答したRafの割合などを定量的に捉えることにも成功した。細胞質中の分子について１分子計測をおこない、特に、細胞内反応ネットワークとの相互作用による変化を検出した点、さらに、応答による変化を定量的に捉えた点に関しては、世界でも初めての画期的な成果である。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(7 results)
