ヘムトランスポーターの動的結晶構造解析

• Project Area: Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
• Project/Area Number: 15H01655
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 杉本 宏 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (90344043)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥12,220,000 (Direct Cost: ¥9,400,000、Indirect Cost: ¥2,820,000); Fiscal Year 2016: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2015: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
• Keywords: ヘム / X線結晶構造解析 / 生体分子 / 量子ビーム / 金属タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

当初の計画通り、溶液および結晶での時間分解測定に必要な技術開発を進めた。その装置の性能を示すために、モデル系としてヘムタンパク質の結晶内での反応について時間分解吸収スペクトル測定を行った。ケージドNO試薬を「タンパク質結晶」に浸潤し、励起用紫外レーザー照射で遊離させたNOが結晶内のヘム鉄に結合する過程のスペクトル変化を時間分解測定した。この結果を踏まえて、SACLA施設での予備的な実験も行い、反応を開始して20ミリ秒後には基質が活性部位へ結合していることを電子密度で確認した。生化学実験の手法として、リポソーム再構成系を用いてヘムトランスポーターの輸送活性の測定方法を開発した。従来のピリジン法やルミノール法によるヘムの定量法では、ヘムの疎水性が高いためにリポソームへの吸着が影響して正確な測定は不可能だった。そこで、ヘムを受け渡すペリプラズムヘム結合タンパク質にGFPを融合したものを測定系に利用した。ヘムがトランスポーター側へ移動することによって蛍光強度が増大することを見出し、高感度でヘムの輸送を定量することが可能になった。この手法を用いて変異体の活性の評価を行った結果、分子内に見出された大きなヘム輸送チャネルの表面の残基には効率的な輸送を可能にするユニークな動的性質があることが明らかとなった。この結果は、構造解析の成果と合わせて学術誌に掲載された。また、A03計画班と連携し、生体膜内でのヘムトランスポーターの全原子分子動力学計算を行うための初期パラメータ等の準備に着手し、MDシミュレーションを行った。この結果を基に、今後ターゲットMDや反応パス解析へ展開する計画である。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure of bacterial haem importer complex in the inward-facing conformation (2016)
  • Author(s): Naoe, Y., Nakamura, N., Doi, A., Sawabe, M., Nakamura, H., Shiro, Y., Sugimoto, H.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 7 Issue: 1 Pages: 13411-13411
  • DOI: 10.1038/ncomms13411
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Nearly On-axis Spectroscopic System for Simultaneously Measuring UV-visible Absorption and X-ray Diffraction in the SPring-8 Structural Genomics Beamline (2016)
  • Author(s): M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
  • Journal Title: J. Synchro. Rad. Volume: 23 Issue: 1 Pages: 334-338
  • DOI: 10.1107/s1600577515018275
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystal Structure of Response Regulator ChrA in the Heme-Sensing Two-Component System of Corynebacterium diphtheriae (2015)
  • Author(s): A. Doi, H. Nakamura, Y. Shiro, H. Sugimoto
  • Journal Title: Acta Crysll. F Volume: 71 Issue: 8 Pages: 966-971
  • DOI: 10.1107/s2053230x15009838
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Structural and functional analysis of a periplasmic heme-binding protein in bacterial heme importer system (2016)
  • Author(s): Md. Mahfuzur Rahman, Nozomi Nakamura, Hiro Nakamura, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro
  • Organizer: The 16th annual meeting of the Protein Science Society of Japan
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07
• [Presentation] Structure of bacterial heme importer in complex with the periplasmic heme-binding protein (2016)
  • Author(s): Hiroshi Sugimoto
  • Organizer: Mini-Symposium on Structure-Based Bioenergetics
  • Place of Presentation: SPring-8上坪ホール（兵庫県・佐用郡）
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Diverse mechanism of the heme-recognition in the bacterial heme import system (2016)
  • Author(s): Hiroshi Sugimoto
  • Organizer: RIKEN SPring-8 Center/University of Hyogo/University of Liverpool Mini-Symposium
  • Place of Presentation: SPring-8上坪ホール（兵庫県・佐用郡）
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural basis of the bacterial heme transporter (2015)
  • Author(s): Hiroshi Sugimoto
  • Organizer: International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2015)
  • Place of Presentation: アメリカ, ホノルル, Hawaii Convention Center
  • Year and Date: 2015-12-15
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural analysis of a periplasmic heme-binding protein in bacterial heme importer system (2015)
  • Author(s): Md. Mahfuzur Rahman, Nozomi Nakamura, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro
  • Organizer: 13th Asian Crystallographic Association Meeting (AsCA 2015)
  • Place of Presentation: India, Kolkata, Science City
  • Year and Date: 2015-12-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 結晶構造に基づく病原菌由来ヘムトランスポーターの基質輸送機構の解明 (2015)
  • Author(s): 中村希，直江洋一，土井章弘，杉本宏，城 宜嗣
  • Organizer: 平成27年度日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 大阪府堺市大阪府立大学
  • Year and Date: 2015-10-17
• [Presentation] 病原菌由来ヘムトランスポーターの結晶構造に基づく基質輸送機構 (2015)
  • Author(s): 中村希、直江洋一、土井章弘、中村寛夫、杉本宏、城宜嗣
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 徳島県徳島市あわぎんホール
  • Year and Date: 2015-06-25
• [Presentation] Structural basis of the heme recognition by bacterial heme transporter (2015)
  • Author(s): Nozomi Nakamura, Youichi Naoe, Akihiro Doi, Hiro Nakamura, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro
  • Organizer: Metals in Biology in Wako
  • Place of Presentation: 埼玉県和光市理化学研究所
  • Year and Date: 2015-06-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structure and mechanism of bacterial heme transporter (2015)
  • Author(s): Hiroshi Sugimoto, Youichi Naoe, Nozomi Nakamura, Akihiro Doi, Hiro Nakamura, Yoshitsugu Shiro
  • Organizer: Metals in Biology in Wako
  • Place of Presentation: 埼玉県和光市理化学研究所
  • Year and Date: 2015-06-16
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 病原菌が鉄を細胞内に取り込む仕組み －細胞膜で働くヘム輸送体タンパク質の立体構造を解明－
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2016/20161110_1/
• [Remarks] 病原菌が鉄を細胞内に取り込む仕組み －細胞膜で働くヘム輸送体タンパク質の立体構造を解明－
  • URL: http://www.spring8.or.jp/ja/news_publications/press_release/2016/161110/