Reaction Chase of a Very Small Amount of Enzyme Protein by the Droplet Collision Method

• Project Area: Science on Function of Soft Molecular Systems by Cooperation of Theory and Experiment
• Project/Area Number: 16H00848
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 小倉 尚志 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (70183770)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000); Fiscal Year 2017: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2016: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
• Keywords: 酵素反応 / 高速混合器 / 微小液滴 / インクジェット / 分光測定 / 反応ダイナミクス / 機能メカニズム / 酵素 / インクジェットヘッド / 振動分光 / 液滴 / タンパク質 / 酵素反応機構 / ES複合体 / 吸収分光

Outline of Annual Research Achievements

いかなる生命現象も突き詰めるとタンパク質が駆動する化学反応がもとになっている。したがって、生命とは何か？という問いに答えるためには、タンパク質の機能メカニズムを明らかにする必要がある。この目的のためにはタンパク質の立体構造とダイナミクスの情報が不可欠である。本研究の目的は、タンパク質の構造ダイナミクスを研究するための微量高速混合装置の試作である。構想では、2つのインクジェットヘッドから高速（1～10 m/s）で吐出される微量（100 pL～1 nL）の酵素および基質をそれぞれ含む液滴を衝突させることによって混合し、酵素反応を開始させて分光法により時間軸に沿って追跡する。
2台のインクジェットヘッドをそれぞれxyzθ軸微動ステージに固定したミキサーを製作した。そして、2つの液滴の衝突・混合を行った。一方、微量試料（80 μl）用吸い上げ式ヘッドについては、電圧パルス印加前に試料溶液が流れ出さないよう保持するために±5 kPa程度の安定した微圧を発生する必要があり、そのための微圧発生装置を組立てた。それを用いて吸い上げ式ヘッドによる液滴の吐出に成功した。ここまでを平成２７年度までに行った。
平成２８年度にはフェノールレッドの蛍光強度がpHにより変化する性質を用いて混合の時定数を求めた。すなわち、フェノールレッドのアルカリ性溶液と酸性緩衝液を衝突させ、最終pHを酸性にすることにより、蛍光光度が低下する性質を利用した。この測定結果より、液滴速度3.8 m/sのとき、混合の時定数は300マイクロ秒と決定した。この装置によりペルオキシダーゼ（西洋わさび由来）と過酸化水素を混合してCompound Iを生成する系を測定中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

２台のインクジェットヘッドから吐出される２つの液滴を衝突させて混合するミキサーを組み立てた。その混合時定数を測定したところ、300マイクロ秒であった。この装置を酵素タンパク質であるペルオキシダーゼに応用する実験に取りかかった。

Strategy for Future Research Activity

ペルオキシダーゼの系により、酵素タンパク質への応用の可能性を確かめる。次にシトクロムc酸化酵素に応用し、嫌気性を保った測定系に発展させる。また、合成タンパク質など微量しか得られない試料に対して応用していく。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Ewha Woman's University/Daegu Gyeongbuk Inst. Sci. & Tech.(韓国)
• [Int'l Joint Research] Stanford University/University of Louisville(米国)
• [Journal Article] Improved Stopped-Flow Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy Device for Studying Enzymatic Reactions (2017)
  • Author(s): S. Yanagisawa, M. S. Deshpande, S. Hirota, T. Nakagawa, and T. Ogura
  • Journal Title: Journal of Raman Spectroscopy Volume: 48 Issue: 5 Pages: 680-685
  • DOI: 10.1002/jrs.5100
  • NAID: 120006334945
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Model for the Active-Site Formation Process in DMSO Reductase Family Molybdenum Enzymes Involving Oxido－Alcoholato and Oxido－Thiolato Molybdenum(VI) Core Structures (2016)
  • Author(s): Hideki Sugimoto, Masanori Sato, Kaori Asano, Takeyuki Suzuki, Kaoru Mieda, Takashi Ogura, Takashi Matsumoto, Logan J. Giles, Amrit Pokhrel, Martin L. Kirk, and Shinobu Itoh
  • Journal Title: Inorg. Chem. Volume: 55 Issue: 4 Pages: 1542-1550
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b02395
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Purification of Active Respiratory Supercomplex from Bovine Heart Mitochondria Enables Functional Studies (2016)
  • Author(s): Kyoko Shinzawa-Itoh, Harunobu Shimomura, Sachiko Yanagisawa, Satoru Shimada, Ryoko Takahashi, Marika Oosaki, Takashi Ogura, and Tomitake Tsukihara
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 291 Issue: 8 Pages: 4187-4184
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.680553
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Reactivity of a Cobalt(III)-Hydroperoxo Complex in Electrophilic Reactions. (2016)
  • Author(s): Shin, B., Sutherlin, K. D., Ohta, T., Ogura, T., Solomon, E. I., & Cho, J.
  • Journal Title: Inorganic Chemistry Volume: 55 Issue: 23 Pages: 12391-12399
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.6b02288
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Ruthenium(III)-Oxyl Complex Bearing Strong Radical Character (2016)
  • Author(s): Y. Shimoyama, T. Ishizuka, H. Kotani, Y. Shiota, K. Yoshizawa, K. Mieda, T. Ogura, T. Okajima, S. Nozawa, T. Kojima
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 55 Issue: 45 Pages: 14041-14045
  • DOI: 10.1002/anie.201607861
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] New Mechanistic Insight into Intramolecular Arene Hydroxylation Initiated by (m-1,2-Peroxo)diiron(III) Complexes with Dinucleating Ligands (2016)
  • Author(s): M. Sekino, H. Furutachi et. al.
  • Journal Title: Danton Trans. Volume: 45 Issue: 2 Pages: 469-473
  • DOI: 10.1039/c5dt04088d
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Nearly On-axis Spectroscopic System for Simultaneously Measuring UV-visible Absorption and X-ray Diffraction in the SPring-8 Structural Genomics Beamline (2016)
  • Author(s): M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
  • Journal Title: J. Synchro. Rad. Volume: 23 Issue: 1 Pages: 334-338
  • DOI: 10.1107/s1600577515018275
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The secondary coordination sphere and axial ligand effects on oxygen reduction reaction by iron porphyrins: a DFT computational study. (2016)
  • Author(s): Ohta, T., Nagaraju, P., Liu, J. G., Ogura, T., & Naruta, Y.
  • Journal Title: Journal of Biological Inorganic Chemistry Volume: 21 Issue: 5-6 Pages: 745-755
  • DOI: 10.1007/s00775-016-1380-9
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The secondary coordination sphere controlled reactivity of a ferric-superoxo heme: unexpected conversion to a ferric hydroperoxo intermediate by reaction with a high-spin ferrous heme. (2016)
  • Author(s): Nagaraju, P., Ohta, T., Liu, J. G., Ogura, T., & Naruta, Y.
  • Journal Title: Chem. Commun. (Camb.) Volume: 52 Issue: 45 Pages: 7213-7216
  • DOI: 10.1039/c6cc02162j
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Heme Orientation of Cavity Mutant Hemoglobins (His F8 --> Gly) in Either alpha or beta Subunits: Circular Dichroism, (1) H NMR, and Resonance Raman Studies (2016)
  • Author(s): Nagai, M., Nagai, Y., Aki, Y., Sakurai, H., Mizusawa, N., Ogura, T., Kitagawa, T., Yamamoto, Y. and Nagatomo, S.
  • Journal Title: Chirality Volume: 28 Pages: 585-592
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Formation and High Reactivity of the anti-Dioxo Form of High- Spin m-Oxodioxodiiron(IV) as the Active Species That Cleaves Strong C (2016)
  • Author(s): Masahito Kodera,* Shin Ishiga, Tomokazu Tsuji, Katsutoshi Sakurai, Yutaka Hitomi, Yoshihito Shiota, P. K. Sajith, Kazunari Yoshizawa, Kaoru Mieda, and Takashi Ogura
  • Journal Title: Chemistry A European Journal Volume: 17 Issue: 17 Pages: 1-14
  • DOI: 10.1002/chem.201600048
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Effects of Heme Electronic Structure and Distal Polar Interaction on Functional and Vibrational Properties of Myoglobin (2016)
  • Author(s): Y. Kanai, R. Nishimura, K. Nishiyama, T. Shibata, S. Yanagisawa, T. Ogura, T. Matsuo, S. Hirota, S. Neya, A. Suzuki, Y. Yamamoto
  • Journal Title: Inorg. Chem. Volume: 55 Issue: 4 Pages: 1613-1622
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b02520
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A Manganese(V)-Oxo Complex: Synthesis by Dioxygen Activation and Enhancement of Its Oxidizing Power by Binding Scandium Ion. (2016)
  • Author(s): Hong, S., Lee, Y. M., Sankaralingam, M., Vardhaman, A. K., Park, Y. J., Cho, K. Ogura, T., Sarangi, R., Fukuzumi, S. and Nam, W.
  • Journal Title: J. Am. Chem. Soc. Volume: 138 Issue: 27 Pages: 8523-8532
  • DOI: 10.1021/jacs.6b03874
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The functional role of the structure of the dioxo-isobacteriochlorin in the catalytic site of cytochrome cd1 for the reduction of nitrite (2016)
  • Author(s): H. Fujii, D. Yamaki, T. Ogura, M. Hada
  • Journal Title: Chem. Sci. Volume: 7 Issue: 4 Pages: 2896-2906
  • DOI: 10.1039/c5sc04825g
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] チトクロムc酸化酵素の水素結合状態変化の酸素還元反応への影響 (2016)
  • Author(s): 青柳裕大, 西口達人, 新澤-伊藤 恭子, 吉川信也, 中島 聡, 小倉尚志
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
• [Presentation] 時間分解共鳴ラマン分光法によるチトクローム酸化酵素の共役機構 (2016)
  • Author(s): 中島 聡, 中川善之, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
• [Presentation] Elucidating the mechanisms of proton pumping in cytochrome c oxidase by time resolved IR spectroscopy (2016)
  • Author(s): Chen Li, Tatsuhito Nishiguchi, Shun Yamauchi, Kyoko Shinzawa-Itoh, Shinya Yoshikawa, Satoru Nakashima, Takashi Ogura
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
• [Presentation] 共鳴ラマン分光法による2価コバラミンの軸配位子に依存した構造変化の検出 (2016)
  • Author(s): 三枝 馨, Abdullah Al Mamun, Pawel M. Kozlowski, 小倉尚志
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
• [Presentation] 四量体ヒトヘモグロビンにおける2つのα鎖に特有のFe-His結合と四次構造との関連 (2016)
  • Author(s): 長友重紀, 齋藤一弥, 長井雅子, 小倉尚志, 北川禎三
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
• [Presentation] 液滴衝突法による微量タンパク質の反応追跡 (2016)
  • Author(s): 小倉尚志, 渡部明莉, 西畑佳晃, 程上紗央里, 渡邉祥子, 柳澤幸子, 中島 聡
  • Organizer: 新学術領域「柔らかな分子系」第4回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学（名古屋市）
  • Year and Date: 2016-10-27
• [Presentation] Catalytic Substrate Oxidation by Ruthenium(II)-Aqua Complexes Bearing N-Heterocyclic Carbene Ligands (2016)
  • Author(s): Shimoyama, Y., Ishizuka, T., Kotani, H., Mieda, K., Ogura, T., Shiota, Y., Kojima, T.
  • Organizer: 錯体化学会第66回討論会
  • Place of Presentation: 福岡大学（福岡市）
  • Year and Date: 2016-09-10
• [Presentation] A new method of assaying the hydrogenase activity by means of Raman spectroscopy (2016)
  • Author(s): K. Nishikawa, S. Inomata, Y. Kawahara, K. Fukutani, T. Yagi, T. Ogura, & Y. Higuchi
  • Organizer: 11th International Hydrogenase Conference
  • Place of Presentation: Marseille (France)
  • Year and Date: 2016-07-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 時間分解振動分光法によるチトクロームc酸化酵素のプロトンポンプ共役機構の研究 (2016)
  • Author(s): 中島 聡, 中川善之, Li Chen, 新澤-伊藤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • Organizer: 第43回生体分子科学討論会
  • Place of Presentation: 名古屋大学（名古屋市）
  • Year and Date: 2016-06-24
• [Presentation] キャビティ内に形成した三核銅中心の性質とマルチ銅酸化酵素との関連 (2016)
  • Author(s): 永田光知郎, 畑中 翼, 岩崎友哉, 小澤智宏, 猪股智彦, 小倉尚志, 舩橋靖博
  • Organizer: 第26回金属の関与する生体関連反応シンポジウム（SRM2016）
  • Place of Presentation: 北海道大学（札幌市）
  • Year and Date: 2016-06-17
• [Presentation] チトクローム酸化酵素の反応サイトの時間分解ラマン分光法による動的構造解析 (2016)
  • Author(s): 中島 聡, 中川善之, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07
• [Presentation] X線自由電子レーザーを用いた、ポンプ・プローブ法によるチトクロム酸化酵素の時分割結晶構造解析 (2016)
  • Author(s): 波多野啓太, 島田敦広, 宮本朱梨, 馬場清喜, 山下 恵太郎, 久保 稔, 吾郷日出夫, 平田邦夫, 上野 剛, 村上宏典, 山本雅貴, 熊坂 崇, 山下栄樹, 小倉尚志, 月原冨武, 吉川信也
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07
• [Presentation] 酵素に結合した感応性化学種の振動分光法による選択的検出と反応機構 (2016)
  • Author(s): 小倉尚志, 渡邉祥子, 柳澤幸子, 中島 聡
  • Organizer: 新学術領域「感応性化学種」第６回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 広島大学東広島キャンパス（東広島市鏡山）
  • Year and Date: 2016-05-20
• [Book] フロンティア生物無機化学（第４章呼吸系を分担） (2016)
  • Author(s): 小倉尚志（伊東 忍・青野重利・林 高史編著）
  • Total Pages: 23
  • Publisher: 三共出版
• [Remarks] 兵庫県立大学 生命理学研究科 ピコバイオロジー専攻 生体物質構造学II分野
  • URL: http://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/biophys2/index-j.html