リポクオリティと膜蛋白質の相互作用のNMR解析法の開発

• Project Area: Quality of lipids in biological systems
• Project/Area Number: 16H01368
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 大澤 匡範 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (60361606)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000); Fiscal Year 2017: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2016: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
• Keywords: 多価不飽和脂肪酸 / アラキドン酸 / 電位依存性プロトンチャネル / NMR / ITC / リポクオリティ / 膜タンパク質 / 相互作用 / 脂質二重膜 / 脂質 / ナノディスク

Outline of Annual Research Achievements

電位依存性プロトンチャネルHv1は、膜の脱分極や細胞内外のpH差を感受して活性化し、細胞内からH+を排出することで細胞内pHや膜電位を調節する。Hv1は、アラキドン酸（AA）やアナンダミドなどの多価不飽和脂肪酸が直接結合することで活性が調節され、貪食細胞における異物の排除や精子鞭毛運動の活性化に寄与している。しかし、これらの脂質がHv1の活性を調節する分子機構は分かっていない。本研究では、脂質のアシル基とタンパク質との相互作用を直接観測できる溶液NMR法を用いることで、AAによるHv1の活性調節機構の原子レベルでの解明を試みた。
N、C末端細胞内領域の一部を切除したマウスHv1を大腸菌で発現し、界面活性剤存在下で精製した。ゲルろ過と分子間架橋試薬により会合状態を調べた結果、精製したHv1は二量体であることが分かった。Hv1の機能構造は二量体であるが、二量体中の各サブユニットの相対配向は明らかでない。そこで、溶液NMR法による分子間NOE測定と部位特異的架橋実験により、サブユニット間の近接残基対を同定し、Hv1の二量体モデルを作成した。次に、AAとHv1の結合様式を等温滴定型カロリメトリー（ITC）により調べた。測定条件を最適化することで、AAの結合に伴う遅い発熱反応の検出に成功し、Hv1二量体に対して2分子のAAが約1 μMの解離定数で結合することが分かった。さらに、相互作用に関わるHv1とAAの原子対を決定するため、Hv1二量体に対して2等量のAAを添加した条件で溶液NMR法による分子間NOE測定を行った結果、AAはHv1の細胞外側の二量体界面に結合することが分かった。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Structural basis for the ethanol action on G-protein?activated inwardly rectifying potassium channel 1 revealed by NMR spectroscopy (2018)
  • Author(s): Toyama Yuki、Kano Hanaho、Mase Yoko、Yokogawa Mariko、Osawa Masanori、Shimada Ichio
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 115 Issue: 15 Pages: 3858-3863
  • DOI: 10.1073/pnas.1722257115
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of the multimeric structure of poly(A)-binding protein on a poly(A) tail (2018)
  • Author(s): Sawazaki Ryoichi、Imai Shunsuke、Yokogawa Mariko、Hosoda Nao、Hoshino Shin-ichi、Mio Muneyo、Mio Kazuhiro、Shimada Ichio、Osawa Masanori
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Issue: 1 Pages: 1455-1455
  • DOI: 10.1038/s41598-018-19659-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nuclear Magnetic Resonance Approaches for Characterizing Protein-Protein Interactions (2017)
  • Author(s): Toyama Yuki、Mase Yoko、Kano Hanaho、Yokogawa Mariko、Osawa Masanori、Shimada Ichio
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology (invited review) Volume: 1684 Pages: 115-128
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-7362-0_10
  • ISBN: 9781493973613, 9781493973620
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ATP-dependent modulation of MgtE in Mg2+ homeostasis (2017)
  • Author(s): Tomita Atsuhiro、Zhang Mingfeng、Jin Fei、Zhuang Wenhui、Takeda Hironori、Maruyama Tatsuro、Osawa Masanori、Hashimoto Ken-ichi、Kawasaki Hisashi、Ito Koichi、Dohmae Naoshi、Ishitani Ryuichiro、Shimada Ichio、Yan Zhiqiang、Hattori Motoyuki、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 8 Issue: 1 Pages: 148-148
  • DOI: 10.1038/s41467-017-00082-w
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dynamic regulation of GDP binding to G proteins revealed by magnetic field-dependent NMR relaxation analyses (2017)
  • Author(s): Yuki Toyama, Hanaho Kano, Yoko Mase, Mariko Yokogawa, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • Journal Title: Nat. Commun. Volume: 8 Issue: 1 Pages: 14523-14523
  • DOI: 10.1038/ncomms14523
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Disulfide mapping the voltage-sensing mechanism of a voltage-dependent potassium channel (2016)
  • Author(s): Tomohiro Nozaki, Shin-ichiro Ozawa, Hitomi Harada, Tomomi Kimura, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Issue: 1 Pages: 37303-37303
  • DOI: 10.1038/srep37303
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] B型肝炎ウイルスの粒子形成機構の解明 (2018)
  • Author(s): 横川 真梨子、石場 智彬、池田 寿子、藤田 浩平、横田 旭美、大澤 匡範
  • Organizer: 日本薬学会 第138年会
• [Presentation] 電位依存性カリウムイオンチャネルhERGの閉状態の安定化による、hERG開閉機構の構造生物学的解明 (2018)
  • Author(s): 松村 一輝、簗瀬 尚美、秋元 まどか、岩崎 菜々美、坂本 多穗、黒川 洵子、横川 真梨子、大澤 匡範
  • Organizer: 日本薬学会 第138年会
• [Presentation] Dynamic regulation of GDP binding to G proteins revealed by magnetic field-dependent NMR relaxation analyses (2017)
  • Author(s): Yuki Toyama, Hanaho Kano, Yoko Mase, Mariko Yokogawa, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • Organizer: 58th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference
  • Place of Presentation: Asilomar Conference Grounds, Pacific Grove, California, USA
  • Year and Date: 2017-03-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural mechanism underlying the millisecond gating of K+ channel (2017)
  • Author(s): Yuta Iwahashi, Yuki Toyama, Shunsuke Imai, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • Organizer: 58th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference
  • Place of Presentation: Asilomar Conference Grounds, Pacific Grove, California, USA
  • Year and Date: 2017-03-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] B型肝炎ウイルスの粒子形成機構の解明 (2017)
  • Author(s): 横川 真梨子、石場 智彬、池田 寿子、藤田 浩平、横田 旭美、大澤 匡範
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会
• [Presentation] ポリA上のPABP多量体による翻訳調節メカニズムの解明 (2017)
  • Author(s): 沢崎 綾一、今井 駿輔、横川 真梨子、細田 直、星野 真一、三尾 和弘、三尾 宗代、嶋田 一夫、大澤 匡範
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会
• [Presentation] 電位依存性プロトンチャネルVSOP/Hv1のアラキドン酸による活性化促進機構の解明 (2017)
  • Author(s): 松葉 広昭、横川 真梨子、木村 友美、望月 綾野、川鍋 陽、岡村 康司、嶋田 一夫、大澤 匡範
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会
• [Presentation] 緩和速度の磁場依存性解析によるGタンパク質へのGDP結合の動的制御機構の解明 (2017)
  • Author(s): 外山 侑樹, 加納 花穂, 間瀬 瑶子, 横川 真梨子, 大澤 匡範, 嶋田 一夫
  • Organizer: 第56回NMR討論会
• [Presentation] Dynamic regulation of GDP binding to G proteins revealed by magnetic field-dependent NMR relaxation analyses (2017)
  • Author(s): Hanaho Kano, Yuki Toyama, Yoko Mase, Mariko Yokogawa, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • Organizer: 2017 Taiwan-Japan Biomedical Symposium on Magnetic Resonance
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Gタンパク質のファミリー選択的なK+チャネル活性制御機構の解明 (2017)
  • Author(s): 加納 花穂, 外山 侑樹, 岩橋 優太, 間瀬 瑶子, 横川 真梨子, 大澤 匡範, 嶋田 一夫
  • Organizer: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] カリウムチャネルのミリ秒オーダーの開閉の構造機構の解明 (2017)
  • Author(s): 岩橋 優太、外山 侑樹、今井 駿輔、大澤 匡範、嶋田 一夫
  • Organizer: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Structure-Free化合物ライブラリー解析システムの構築と検証 (2017)
  • Author(s): 池田和由、清水祐吾、大澤匡範
  • Organizer: 第45回 構造活性相関シンポジウム
• [Presentation] 生物活性情報に基づく構造非開示での化合物ライブラリー多様性評価法の開発 (2017)
  • Author(s): 清水祐吾、池田和由、大澤匡範
  • Organizer: 第45回 構造活性相関シンポジウム
• [Presentation] Development of structure-free analysis for compound libraries based on chemical and bioactive diversity (2017)
  • Author(s): Yugo Shimizu, Kazuyoshi Ikeda, Masanori Osawa
  • Organizer: CBI学会
• [Presentation] Developments and applications of multiple quantum NMR methods to characterize functional dynamics of high molecular weight proteins (2016)
  • Author(s): Yuki Toyama, Hanaho Kano, Yoko Mase, Mariko Yokogawa, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • Organizer: The 54th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular mechanism of the ATP-dependent modulation of the Mg2+ channel MgtE for Mg2+ homeositasis (2016)
  • Author(s): Atsuhiro Tomita, Mingfeng Zhang, Hironori Takeda, Fei Jin, Tatsuro Maruyama, Masanori Osawa, Ryuichiro Ishitani, Ichio Shimada, Zhiqiang Yan, Motoyuki Hattori, Osamu Nureki
  • Organizer: The 54th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural basis for the inhibition of voltage-dependent K+ channel by gating modifier toxin (2016)
  • Author(s): Masanori Osawa, hin-ichiro Ozawa, Tomomi Kimura, Tomohiro Nozaki, Hitomi Harada, Ichio Shimada
  • Organizer: The 42nd Naito Conference
  • Place of Presentation: シャトレーゼガトーキングダム（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2016-10-04
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Gating modifier toxinによる電位依存性K+チャネル阻害の構造基盤 (2016)
  • Author(s): 大澤匡範
  • Organizer: 第60回日本薬学会関東支部大会
  • Place of Presentation: 東京大学（東京都文京区）
  • Year and Date: 2016-09-17
  • Invited
• [Presentation] Functional Roles of Mg2+-Binding Sites in Mg2+-Dependent Gating of an Mg2+ Channel, MgtE,Revealed by NMR (2016)
  • Author(s): Tatsuro Maruyama, Shunsuke Imai, Motoyuki Hattori, Ryuichiro Ishitani, Osamu Nureki, Ichio Shimada, Masanori Osawa
  • Organizer: The 27th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural Basis for the Inhibition of Voltage-dependent K+ Channel by Gating Modifier Toxin (2016)
  • Author(s): Shin-ichiro Ozawa, Tomomi Kimura, Tomohiro Nozaki, Hitomi Harada, Ichio Shimada, Masanori Osawa
  • Organizer: The 27th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural Characterization of PABP Multimerization on Poly(A) Tail (2016)
  • Author(s): Ryoichi Sawazaki, Shunsuke Imai, Mariko Yokogawa, Yoko Usui, Takeru Sagae, Shin-ichi Hoshino, Ichio Shimada, Masanori Osawa
  • Organizer: The 27th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural Basis for Voltage-Sensing Mechanism of a Voltage-Dependent Potassium Channel (2016)
  • Author(s): Tomohiro Nozaki, Shin-ichiro Ozawa, Hitomi Harada, Tomomi Kimura, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • Organizer: The 27th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] NMR Method for Characterizing Microsecond-to-Millisecond Chemical Exchanges Utilizing (2016)
  • Author(s): Yuki Toyama, Masanori Osawa, Mariko Yokogawa, Ichio Shimada
  • Organizer: The 27th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural basis for the inhibition of voltage-dependent K+ channel by gating modifier toxin (2016)
  • Author(s): Shin-ichiro Ozawa, Tomomi Kimura, Tomohiro Nozaki, Hitomi Harada, Ichio Shimada, Masanori Osawa
  • Organizer: International and Interdisciplinary Symposium 2016
  • Place of Presentation: 東京医科歯科大学（東京都文京区）
  • Year and Date: 2016-07-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] NMR Method for Characterizing Microsecond-to-Millisecond Chemical Exchanges Utilizing Differential Multiple-Quantum Relaxation in High Molecular Weight Protein (2016)
  • Author(s): Yuki Toyama, Masanori Osawa, Mariko Yokogawa, Ichio Shimada
  • Organizer: 第16回東京大学生命科学シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学（東京都文京区）
  • Year and Date: 2016-04-23
• [Remarks] 慶應義塾大学 薬学部・薬学研究科 生命機能物理学
  • URL: http://www.pha.keio.ac.jp/research/mfp/index.html