Development of improved ZIP tag-probe system for fluorescent imaging of protein synthesis in cells

• Project Area: Resonance Biology for Innovative Bioimaging
• Project/Area Number: 16H01420
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 野村 渉 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 准教授 (80463909)
• Project Period (FY): 2016-06-30 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥11,050,000 (Direct Cost: ¥8,500,000、Indirect Cost: ¥2,550,000); Fiscal Year 2017: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2016: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
• Keywords: 蛍光イメージング / ゲノム編集 / CRISPR-Cas9 / 分子進化 / タンパク質 / タグープローブ / 蛋白質 / ゲノム / 核酸 / ペプチド / 可視化

Outline of Annual Research Achievements

生体高分子や代謝産物などを標的とした蛍光イメージングは非侵襲的に細胞や個体を観察可能なことから，それまで明らかでなかった細胞内イベントを解明することに役立っている。ゲノム編集技術は主にゲノム上の標的配列を特異的に切断するヌクレアーゼの作用によって修復時に変異が導入され，タンパク質のノックアウトに利用される。ここ数年でのCRISPR-Cas9の開発によって従来と比較して研究期間の大幅な短縮が実現されている。また，ゲノム上でのタンパク質配列の改変などこれまでとは異なる利用方法の実現が望まれている。本研究ではゲノム上の標的タンパク質遺伝子にタグ遺伝子を導入して，恒常的なタンパク質発現という条件下での観察手法を開発する。そのために，蛍光イメージング法とゲノム編集技術を組み合わせた，より高精度なタンパク質挙動観察の手法を確立する。これまでに開発してきたタグ-プローブシステムはタンパク質に遺伝子工学的に導入することができ，タグ-プローブペアの会合とほぼ同時に蛍光の増大が見られる。この特長を利用してタンパク質蛍光イメージングの問題点を克服するシステムを構築する。本年度は従来タグ配列として用いてきた二本鎖へリックスに環境応答性蛍光基NBDを導入し，より低分子量の1本鎖へリックスをタグ配列とするシステムの可能性を検討した。タグペプチドによる標的タンパク質機能への影響を抑制するためである。このシステムにおいてもストップトフローを利用した測定によって1秒以内での蛍光増大が確認され，細胞内にタグ融合型タンパク質を発現させた場合，プローブの導入によってタンパク質の局在解析が可能であることが示唆された。今回は核内に局在するヒストンタンパク質H2Bを対象としたが，細胞内，細胞膜表面などで発現するどのようなタンパク質にも利用できると期待できる。また，ゲノム上へのタグ組込みの可能性を引き続き検討する。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Synthesis of a Chloroalkene Dipeptide Isostere-Containing Peptidomimetic and Its Biological Application (2018)
  • Author(s): Takuya Kobayakawa, Yudai Matsuzaki, Kentaro Hozumi, Wataru Nomura, Motoyoshi Nomizu, Hirokazu Tamamura
  • Journal Title: ACS Med. Chem. Lett. Volume: 9 Issue: 1 Pages: 6-10
  • DOI: 10.1021/acsmedchemlett.7b00234
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Creation of Functional Molecules Based on Biomolecular Interactions; Development toward Chemical Biology (2017)
  • Author(s): 野村 渉
  • Journal Title: YAKUGAKU ZASSHI Volume: 137 Issue: 10 Pages: 1223-1231
  • DOI: 10.1248/yakushi.17-00125
  • NAID: 130006109870
  • ISSN: 0031-6903, 1347-5231
  • Year and Date: 2017-10-01
  • Open Access
• [Journal Article] DNAメチル化制御から精密エピゲノム編集へ (2017)
  • Author(s): 野村 渉
  • Journal Title: MEDCHEM NEWS Volume: 27 Pages: 200-207
  • NAID: 130007755934
• [Journal Article] Synthesis and Evaluation of Dimeric Derivatives of Diacylglycerol-lactones as PKC Ligands (2017)
  • Author(s): Nami Ohashi, Ryosuke Kobayashi, Wataru Nomura, Takuya Kobayakawa, Agnes Czikora, Brienna Herold, Nancy E. Lewin, Peter M. Blumberg, Hirokazu Tamamura
  • Journal Title: Bioconjugate Chem. Volume: 28 Issue: 8 Pages: 2135-2144
  • DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.7b00299
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development of Anti-HIV Peptides Based on a Viral Capsid Protein (2017)
  • Author(s): Takaaki Mizuguchi, Nami Ohashi, Daichi Matsumoto, Chie Hashimoto, Wataru Nomura, Naoki Yamamoto, Tsutomu Murakami, Hirokazu Tamamura
  • Journal Title: Biopolymers: Peptide Science Volume: 印刷中 Issue: 1
  • DOI: 10.1002/bip.22920
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bivalent 14-mer Peptide Ligands of CXCR4 with Polyproline Linkers with Anti-Chemotactic Activity against Jurkat Cells (2017)
  • Author(s): Tomohiro Tanaka, Toru Aoki, Wataru Nomura, Hirokazu Tamamura
  • Journal Title: J. Pept. Sci. Volume: 印刷中 Issue: 7-8 Pages: 574-580
  • DOI: 10.1002/psc.2946
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Microwave-Assisted Synthesis of Azacoumarin Fluorophores and the Fluorescence Characterization (2017)
  • Author(s): Hikaru Takano, Tetsuo Narumi, Wataru Nomura, Hirokazu Tamamura
  • Journal Title: J. Org. Chem. Volume: 82 Issue: 5 Pages: 2739-2744
  • DOI: 10.1021/acs.joc.6b02656
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 多価型CXCR4リガンドの創製とがん細胞イメージング・検出 (2016)
  • Author(s): 野村 渉, 玉村啓和
  • Journal Title: 医学のあゆみ 第5土曜特集「GPCR研究の最前線2016」 Volume: 5 Pages: 430-437
• [Journal Article] 細胞内タンパク質を可視化するタグ-蛍光プローブシステム (2016)
  • Author(s): 野村渉, 玉村啓和
  • Journal Title: 「生化学」みにれびゅう Volume: 89 Pages: 115-120
  • NAID: 40021119837
• [Journal Article] A minimally cytotoxic CD4 mimic as an HIV entry inhibitor (2016)
  • Author(s): Takaaki Mizuguchi, Shigeyoshi Harada, Tomoyuki Miura, Nami Ohashi, Tetsuo Narumi, Hiromi Mori, Yu Irahara, Yuko Yamada, Wataru Nomura, Shuzo Matsushita, Kazuhisa Yoshimura, Hirokazu Tamamura
  • Journal Title: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume: 26 Issue: 2 Pages: 397-400
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2015.11.103
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Small-Molecule CD4 Mimics Containing Mono-cyclohexyl Moieties as HIV Entry Inhibitors. (2016)
  • Author(s): Nami Ohashi1, Shigeyoshi Harada, Takaaki Mizuguchi1, Yu Irahara1, Yuko Yamada, Misato Kotani, Wataru Nomura, Shuzo Matsushita, Kazuhisa Yoshimura, Hirokazu Tamamura.
  • Journal Title: Chem Med Chem Volume: 19 Issue: 8 Pages: 940-946
  • DOI: 10.1002/cmdc.201500590
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Evaluation of Fluorescein-Labeled Derivatives of a Peptide Inhibitor of the EGF Receptor Dimerization (2016)
  • Author(s): Kei Toyama, Takaaki Mizuguchi, Wataru Nomura, Hirokazu Tamamura
  • Journal Title: Bioorg. Med. Chem. Volume: 24 Issue: 16 Pages: 3406-3412
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2016.05.026
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Distinct chemically inducible system for orthogonal differential regulation of endogenous genes (2018)
  • Author(s): Wataru Nomura, Daisuke Matsumoto, Takuya Kobayakawa, Taisuke Sugii, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: Keystone Symposia Conference A2: Precision Genome Engineering
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genome editing with a FokI-based chemically inducible nuclease system (2018)
  • Author(s): Daisuke Matsumoto, Wataru Nomura, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: Keystone Symposia Conference A2: Precision Genome Engineering
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Orthogonal differential regulation of endogenous genes by distinct chemically inducible systems (2018)
  • Author(s): Wataru Nomura, Daisuke Matsumoto, Takuya Kobayakawa, Taisuke Sugii, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: 武田薬科学シンポジウム
• [Presentation] Development of tools for the modification, regulation, and molecular imaging of gene and epigenetic functions (2018)
  • Author(s): Wataru Nomura, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: NCU Global Young Investigator Forum 2018
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 標的タンパク質の動きをみるペプチド性蛍光イメージングツール (2018)
  • Author(s): 野村渉 ,神村拓美 ,森あつみ ,小早川拓也 ,玉村啓和
  • Organizer: 日本薬学会第 138年会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 分割型部位特異的ヌクレアーゼを利用した化合物誘導型ゲノム編集技術の開発 (2017)
  • Author(s): 松本大亮, 野村 渉, 玉村啓和
  • Organizer: 日本化学会第97春季年会
  • Place of Presentation: 慶應義塾大学日吉キャンパス（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2017-03-19
• [Presentation] Controllable genome editing by chemically inducible split site-specific nucleases (2017)
  • Author(s): Daisuke Matsumoto, Wataru Nomura, HIrokazu Tamamura
  • Organizer: 2017 Keystone Symposia Conference A2: Precision Genome Engineering
  • Place of Presentation: Breckenridge, USA
  • Year and Date: 2017-01-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Chemical-inducible artificial transcription factors based on sequence-specificity of TALE and dCas9 (2017)
  • Author(s): Wataru Nomura, Taisuke Sugii, HIrokazu Tamamura
  • Organizer: 2017 Keystone Symposia Conference A2: Precision Genome Engineering
  • Place of Presentation: Breckenridge, USA
  • Year and Date: 2017-01-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] FokIを DNA切断ドメインとして用いた化合物誘導型配列特異的ヌクレアーゼの開発 (2017)
  • Author(s): 松本大亮 ,野村 渉 ,杉井太亮 ,玉村啓和
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第 12回年会
• [Presentation] Development of chemical-inducible artificial transcription factors based on sequence-specific DNA binders (2017)
  • Author(s): Wataru Nomura, Daisuke Matsumoto, Tsukasa Hashimoto, Taisuke Sugii, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: The 254th ACS National Meeting and Exposition
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生体分子間相互作用を制御する機能性ペプチド／タンパク質の設計と応用 (2017)
  • Author(s): 野村 渉
  • Organizer: 熊本大学先端科学研究部セミナー
  • Invited
• [Presentation] Development of genome editing and gene regulation systems utilizing specific DNA binding domains (2017)
  • Author(s): Wataru Nomura
  • Organizer: 熊本大学 HIGO program seminar
  • Invited
• [Presentation] Differential regulation of endogenous genes in an orthogonal manner by distinct chemically inducible systems (2017)
  • Author(s): Wataru Nomura, Daisuke Matsumoto, Takuya Kobayakawa, Taisuke Sugii, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: International Conference on Epigenetics and Bioengineering
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 化合物による誘導が可能な分割型人工ヌクレアーゼの構築とその評価 (2016)
  • Author(s): 松本大亮, 野村 渉, 玉村啓和
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-01
• [Presentation] 化学誘導二量体形成法を応用したゲノム編集ツールの開発 (2016)
  • Author(s): 松本大亮, 野村 渉, 玉村啓和
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会 9.0
  • Place of Presentation: 早稲田大学井深大記念ホール（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2016-11-21
• [Presentation] 生体分子間相互作用を基盤とする機能分子の創製とケミカルバイオロジーへの展開 (2016)
  • Author(s): 野村 渉
  • Organizer: 第60回日本薬学会関東支部大会
  • Place of Presentation: 東京大学山上会館 他（東京都文京区）
  • Year and Date: 2016-09-17
  • Invited
• [Presentation] TALEおよびdCas9を利用した化合物による標的遺伝子特異的な転写活性制御技術 (2016)
  • Author(s): 野村 渉, 杉井太亮, 玉村啓和
  • Organizer: 第10回 バイオ関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂 他（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2016-09-07
• [Presentation] 化合物による制御可能なゲノム編集を目指した分割型人工ヌクレアーゼの構築 (2016)
  • Author(s): 松本大亮, 野村 渉, 玉村啓和
  • Organizer: 第10回 バイオ関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂 他（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2016-09-07
• [Presentation] 末端架橋型ZIPタグプローブペアの創製 (2016)
  • Author(s): 斉藤 歩, 大橋南美, 野村 渉, 玉村啓和
  • Organizer: 第60回日本薬学会関東支部大会
  • Place of Presentation: 東京大学山上会館 他（東京都文京区）
  • Year and Date: 2016-09-07
• [Presentation] 分割型人工ヌクレーゼを用いた化合物誘導型ゲノム編集系の構築 (2016)
  • Author(s): 松本大亮, 野村 渉, 玉村啓和
  • Organizer: 第48回若手ペプチド夏の勉強会
  • Place of Presentation: 大学セミナーハウス（東京都八王子市）
  • Year and Date: 2016-08-01
• [Presentation] Protein dynamics imaging using tag-probe systems (2016)
  • Author(s): Wataru Nomura, Nami Ohashi, HIrokazu Tamamura
  • Organizer: The 14th Chinese International Peptide Symposium & the 5th Asia-Pacific International Peptide Symposium
  • Place of Presentation: Nanjing, China
  • Year and Date: 2016-07-06
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 東京医科歯科大学生体材料工学研究所メディシナルケミストリー分野ホームページ
  • URL: http://tamamura-tmd.sakura.ne.jp/members/teachers/nomura/