“無蛍光”蛍光タンパク質で実現する組織深部分子活性化イメージング

• Project Area: Resonance Biology for Innovative Bioimaging
• Project/Area Number: 16H01437
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: National Institute for Physiological Sciences
• Principal Investigator: 村越 秀治 生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 准教授 (90608142)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥11,050,000 (Direct Cost: ¥8,500,000、Indirect Cost: ¥2,550,000); Fiscal Year 2017: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2016: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
• Keywords: 蛍光タンパク質 / FRET

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、赤色蛍光タンパク質であるmCherryと色素タンパク質であるUltramarineのキメラを作製し、これを鋳型にして、Error-prone PCRによるランダム変異導入により、吸収はあるが量子収率がほぼ0の無蛍光赤色蛍光タンパク質（ShadowR）の開発を進めて来た。作製したキメラ分子は凝集しやすく、また大腸菌内でも封入体に入り易かったため、まずは、キメラ分子の親水性を高くすることでダイマー化や凝集が起こりにくくなるようにすることを目指した。具体的には、キメラ分子のアミノ酸の内、側鎖が外側を向いているアミノ酸をターゲットにして飽和変異導入を行った。変異体の内、吸収の大きいものを大腸菌ライブラリーよりピックアップし、これらのシークエンスを調べた。シークエンスを行った変異体の内、アミノ酸が元のよりもより親水性のアミノ酸に置換されているものをピックアップした。このような操作を数十か所のアミノ酸について行うことにより親水性の高い変異体（ShadowR）を作製することに成功した。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] 光応答性CaMKII阻害ペプチドの開発とシナプス可塑性研究への応用 (2018)
  • Author(s): 村越秀治
  • Journal Title: CLINICAL CALCIUM Volume: 28 Pages: 414-419
• [Journal Article] Kinetics of Endogenous CaMKII Required for Synaptic Plasticity Revealed by Optogenetic Kinase Inhibitor (2017)
  • Author(s): Hideji Murakoshi, Myung Eun Shin, Paula Parra-Bueno, Erzsebet M. Szatmari, Akihiro C.E. Shibata, Ryohei Yasuda
  • Journal Title: Neuron Volume: 94 Issue: 1 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2017.02.036
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ShadowY: a dark yellow fluorescent protein for FLIM-based FRET measurement (2017)
  • Author(s): Murakoshi Hideji、Shibata Akihiro C. E.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 7 Issue: 1 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1038/s41598-017-07002-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Imaging signal transduction in dendrites using genetically-encoded fluorescent proteins. (2016)
  • Author(s): Murakoshi H and Yasuda R.
  • Journal Title: Dendritets: development and disease. Volume: - Pages: 139-154
  • Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dual observation of the ATP-evoked small GTPase activation and Ca2+ transient in astrocytes using a dark red fluorescent protein (2016)
  • Author(s): Nakahata Y, Nabekura J, Murakoshi H
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 22 Issue: 1 Pages: 39564-39564
  • DOI: 10.1038/srep39564
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 光らない蛍光タンパク質で細胞内分子活性を見る (2017)
  • Author(s): 村越秀治
  • Organizer: 第2回ルミノジェネティクス研究会
  • Invited
• [Presentation] 2光子蛍光寿命イメージングによる細胞内シグナル伝達解析 (2017)
  • Author(s): 村越秀治
  • Organizer: 第39回神経組織培養研究会
  • Invited
• [Presentation] Optogenetic manipulation and imaging of CaMKII-Rho signaling pathway during synaptic plasticity. (2017)
  • Author(s): Hideji Murakoshi
  • Organizer: 2017 Yonsei Univ-Korea Univ-NIPS symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Spatiotemporal manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines (2016)
  • Author(s): Hideji Murakoshi
  • Organizer: The 47th NIPS International Symposium
  • Place of Presentation: 愛知県 岡崎市 岡崎カンファレンスセンター
  • Year and Date: 2016-10-26
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 村越研究室/生理学研究所/MurakoshiLab
  • URL: http://www.nips.ac.jp/multiphoton/