Redesigning biosynthetic machineries of antitumor macrolide antibiotics

• Project Area: Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries
• Project/Area Number: 17H05434
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 工藤 史貴 東京工業大学, 理学院, 准教授 (00361783)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2018: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2017: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: マクロライド抗生物質 / ポリケチド合成酵素 / 酵素エンジニアリング / 生合成 / タンパク質間相互作用 / 酵素構造解析 / アシル基転移酵素 / タンパク質構造解析 / 遺伝子組換え / マクロライド系抗生物質 / ケミカルバイオロジー / 分子プローブ / 酵素工学 / 遺伝子工学

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、抗腫瘍性マクロライド抗生物質FD-891のポリケチド合成酵素（PKS）の触媒ドメイン間の相互作用機構を解明し、その知見を生かしたPKS遺伝子改変によりスターター部位の異なる類縁体を生合成することを目指した。
本研究期間では、スターター部位の生合成に関わるローディングPKSのアシルキャリアープロテイン（ACP）ドメインとアシル基転移酵素(AT)ドメイン、ACPドメインとβ-ケトアシルACP合成酵素（KS）ドメインの相互作用機構を解明するために、分子プローブを用いてクロスリンク反応させた複合体を精製して結晶化を検討した。また、ACPドメインを単独発現させて、単独発現させたATドメインとKSドメインとのクロスリンク反応による複合体化と結晶化を検討した。いずれの条件においても結晶構造解析に供することのできる結晶は得られていないが、クロスリンク反応の効率が複合体サンプルの純度に大きな影響を与えることがわかった。
遺伝子改変による類縁体創製に関しては、FD-891のローディングPKSのATドメインを、前年度に生合成遺伝子クラスターを決定したビルストマイシン生合成に関わるPKSの基質特異性の異なるATドメインと入れ換えた。相同性のある酵素構造情報を基に境目を決定して入れ換えた結果、一炭素増炭した類縁体と二炭素増炭した類縁体を生合成させることに成功した。一方、メトキシ基を導入した類縁体の生合成も検討したが、期待した化合物を得ることができなかった。入れ換えたATドメインがACPドメインと相互作用できない可能性、KSドメインがメトキシ基を導入した中間体を認識できなかった可能性などが考えられる。今後はうまくできなかった原因を明らかにして、それを解消すべき遺伝子改変を行い新たな類縁体を生合成する予定である。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] An Engineered Aryl Acid Adenylation Domain with an Enlarged Substrate Binding Pocket (2019)
  • Author(s): Ishikawa, F., Miyanaga, A., Kitayama, H., Nakamura, S., Nakanishi, I., Kudo, F., Eguchi, T., Tanabe, G.
  • Journal Title: Angew. Chem. Int. Ed. Volume: 58 Issue: 21 Pages: 6906-6910
  • DOI: 10.1002/anie.201900318
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis of the nonribosomal codes for nonproteinogenic amino acid selective adenylation enzymes in the biosynthesis of natural products (2019)
  • Author(s): Kudo Fumitaka、Miyanaga Akimasa、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology Volume: 46 Issue: 3-4 Pages: 515-536
  • DOI: 10.1007/s10295-018-2084-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional and structural characterization of IdnL7, an adenylation enzyme involved in incednine biosynthesis (2019)
  • Author(s): Cieslak, J., Miyanaga, A., Takaishi, M., Kudo, F., Eguchi, T.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. Volume: 75 Issue: 4 Pages: 299-306
  • DOI: 10.1107/s2053230x19002863
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Total Synthesis of Actinorhodin (2019)
  • Author(s): Ninomiya, M., Ando, Y., Kudo, F., Ohmori, K., Suzuki, K.
  • Journal Title: Angew. Chem. Int. Ed. Volume: 58 Issue: 13 Pages: 4264-4270
  • DOI: 10.1002/anie.201814172
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] C-Methylation Catalyzed by Fom3, a Cobalamin-Dependent Radical S-adenosyl-l-methionine Enzyme in Fosfomycin Biosynthesis, Proceeds with Inversion of Configuration (2018)
  • Author(s): Sato, S., Kudo, F., Kuzuyama, T., Hammerschmidt, F., Eguchi, T.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 57 Issue: 33 Pages: 4963-4966
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.8b00614
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Biochemical and structural analysis of FomD that catalyzes the hydrolysis of cytidylyl (S)-2-hydroxypropylphosphonate in fosfomycin biosynthesis (2018)
  • Author(s): Sato, S., Miyanaga, A., Kim, S. Y., Kuzuyama, T., Kudo, F., Eguchi, T.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 57 Issue: 32 Pages: 4858-4866
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.8b00690
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Basis of Protein-Protein Interactions between a trans-Acting Acyltransferase and Acyl Carrier Protein in Polyketide Disorazole Biosynthesis (2018)
  • Author(s): Miyanaga Akimasa、Ouchi Risako、Ishikawa Fumihiro、Goto Ena、Tanabe Genzoh、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 140 Issue: 25 Pages: 7970-7978
  • DOI: 10.1021/jacs.8b04162
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein-protein interactions in polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase hybrid assembly lines (2018)
  • Author(s): Miyanaga Akimasa、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: Natural Product Reports Volume: 35 Issue: 11 Pages: 1185-1209
  • DOI: 10.1039/c8np00022k
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Carbon-free production of 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) in cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 (2018)
  • Author(s): Watanabe, S., Ozawa, H., Kato, H., Nimura-Matsune, K., Hirayama, T., Kudo, F., Eguchi, T., Kakinuma, K., Yoshikawa, H.
  • Journal Title: Biosci. Biotech. Biochem. Volume: 82 Issue: 1 Pages: 161-165
  • DOI: 10.1080/09168451.2017.1411777
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] NAD+-Dependent Dehydrogenase PctP and PLP-Dependent Aminotransferase PctC Catalyze the First Post-glycosylation Modification of Sugar Intermediate in Pactamycin Biosynthesis (2018)
  • Author(s): Akane Hirayama, Jinmiao Chu, Ena Goto, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 19 Issue: 2 Pages: 126-130
  • DOI: 10.1002/cbic.201700483
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Substrate Recognition by a Dual Functional P450 Monooxygenase Involved in FD-891 Biosynthesis (2017)
  • Author(s): Akimasa Miyanaga, Ryuichi Takayanagi, Takashi Furuya, Ayano Kawamata, Tomohiro Itagaki, Yoshiharu Iwabuchi, Naoki Kanoh, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 18 Issue: 21 Pages: 2179-2187
  • DOI: 10.1002/cbic.201700429
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fosfomycin Biosynthesis via Transient Cytidylylation of 2-Hydroxyethylphosphonate by the Bifunctional Fom1 Enzyme (2017)
  • Author(s): Su-Hee Cho, Seung-Young Kim, Takeo Tomita, Taro Shiraishi, Jin-Soo Park, Shusuke Sato, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi, Nobutaka Funa, Makoto Nishiyama, Tomohisa Kuzuyama
  • Journal Title: ACS Chem. Biol. Volume: 12 Issue: 8 Pages: 2209-2215
  • DOI: 10.1021/acschembio.7b00419
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Methylcobalamin-Dependent Radical SAM C-Methyltransferase Fom3 Recognizes Cytidylyl-2-hydroxyethylphosphonate and Catalyzes the Nonstereoselective C-Methylation in Fosfomycin Biosynthesis (2017)
  • Author(s): Sato Shusuke、Kudo Fumitaka、Kim Seung-Young、Kuzuyama Tomohisa、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 56 Issue: 28 Pages: 3519-3522
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.7b00472
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Analysis of the Dual Function Thioesterase SAV606 Unravels the Mechanism of Michael Addition of Glycine to an α,β-Unsaturated Thioester (2017)
  • Author(s): Taichi Chisuga, Akimasa Miyanaga, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 292 Issue: 26 Pages: 10926-10937
  • DOI: 10.1074/jbc.m117.792549
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of a gene cluster for telomestatin biosynthesis and heterologous expression using a specific promoter in a clean host. (2017)
  • Author(s): 4.Amagai, K., Ikeda, H., Hashimoto, J., Kozone, I., Izumikawa, M., Kudo, F., Eguchi, T., Nakamura, T., Osada, H., Takahashi, S., Shin-ya
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 7 Issue: 1 Pages: 3382-3382
  • DOI: 10.1038/s41598-017-03308-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Biochemical Characterization and Structural Insight into Aliphatic β-Amino Acid Adenylation Enzymes IdnL1 and CmiS6 (2017)
  • Author(s): Jolanta Cieslak, Akimasa Miyanaga, Ryoma Takaku, Makoto Takaishi, Keita Amagai, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • Journal Title: Proteins Volume: 85 Issue: 7 Pages: 1238-1247
  • DOI: 10.1002/prot.25284
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Substrate Specificity of Radical S-Adenosyl-L-methionine Dehydratase AprD4 and Its Partner Reductase AprD3 in the C3′-Deoxygenation of Aminoglycoside Antibiotics (2017)
  • Author(s): Fumitaka Kudo, Takeshi Tsunoda, Makoto Takashima, Tadashi Eguchi
  • Journal Title: J. Antibiot. Volume: 70 Issue: 4 Pages: 423-428
  • DOI: 10.1038/ja.2016.110
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Study on radical SAM C-methyltransferase Fom3 in fosfomycin biosynthesis (2019)
  • Author(s): Fumitaka Kudo
  • Organizer: 2nd China-Japan Joint Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] カナマイシン生合成における脱水素酵素KanD2の基質認識機構 (2019)
  • Author(s): 北山 幸延、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [Presentation] 抗腫瘍抗生物質パクタマイシンの生合成におけるアデニル化酵素と糖転移酵素の機能解析 (2019)
  • Author(s): 張 家浩、平山 茜、工藤 史貴、江口 正
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [Presentation] Radical SAM C-Methylation in Fosfomycin Biosynthesis (2019)
  • Author(s): SATO, Shusuke; KUDO, Fumitaka; KUZUYAMA, Tomohisa; EGUCHI, Tadashi
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [Presentation] ジソラゾール生合成におけるアシル基転移酵素とアシルキャリアプロテイン間の相互作用解析 (2019)
  • Author(s): 後藤 絵菜、大内 理紗子、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [Presentation] 18員環マクロライド抗生物質Virustomycin Aの生合成遺伝子クラスター (2019)
  • Author(s): 岸川 皓典、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [Presentation] マクロラクタム抗生物質クレミマイシン生合成におけるsplit DHドメインの機能解析 (2019)
  • Author(s): 川崎 大輔、千菅 太一、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [Presentation] Functional and structural analysis of unique adenylation enzyme IdnL7 involved in biosynthesis of macrolactam antibiotic incednine (2019)
  • Author(s): CIESLAK, Jolanta; MIYANAGA, Akimasa; KUDO, Fumitaka; EGUCHI, Tadashi
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [Presentation] ホスホマイシン生合成における新規加水分解酵素FomDの機能解析 (2019)
  • Author(s): 佐藤 秀亮、宮永 顕正、工藤 史貴、葛山 智久、江口 正
  • Organizer: 日本農芸化学会2019年度大会 東京農業大学
• [Presentation] Study on a dual functional cytochrome P450 in the biosynthesis of macrolide antibiotic FD-891 (2018)
  • Author(s): Fumitaka Kudo, Akimasa Miyanaga, Tadashi Eguchi
  • Organizer: 3rd European Conference on Natural Products
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Biosynthesis of aminoglycoside antibiotics (2018)
  • Author(s): Fumitaka Kudo
  • Organizer: 1st Japanese-German Symposium, Biosynthesis and Function of Natural Products
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 抗腫瘍抗生物質パクタマイシンの生合成研究 (2018)
  • Author(s): 工藤 史貴、平山 茜、張 家浩、宮永 顕正、江口 正
  • Organizer: 第60回天然有機化合物討論会
• [Presentation] Biosynthesis of β-amino acid containing macrolactam antibiotics (2018)
  • Author(s): Fumitaka Kudo
  • Organizer: The Society for Industrial Microbiology, “2nd International Conference on Natural Product Discovery and Development in the Genomic Era”
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ポリケチド生合成におけるアシル基転移酵素とアシルキャリアタンパク質のクロスリンク反応の検討 (2018)
  • Author(s): 大内理紗子、石川文洋、後藤絵菜、木村真希、宮永顕正、田邉元三、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 日本化学会第98春季年会（2018）（日本大学理工学部 船橋キャンパス）
• [Presentation] Radical SAM enzymes involved in natural product biosynthesis (2017)
  • Author(s): Fumitaka Kudo
  • Organizer: The 18th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (ISBA18), Natural Products; Discovery and Biosynthesis I
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ホスホマイシン生合成におけるC-メチル化機構 (2017)
  • Author(s): 佐藤 秀亮、 Kim Seung-Young、葛山 智久、工藤 史貴、江口 正
  • Organizer: 第59回天然有機化合物討論会（2017）
• [Presentation] Biosynthesis of Carbocyclic Nucleoside Aristeromycin (2017)
  • Author(s): Fumitaka Kudo
  • Organizer: 1st China-Japan Joint Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research / Invited