Construction of terpenoid producing platform in Actinomycetes and creation of novel secondary metabolites

• Project Area: Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries
• Project/Area Number: 17H05455
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 高橋 俊二 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, ユニットリーダー (30311608)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2018: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2017: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
• Keywords: 生合成プラットフォーム / 放線菌 / テルペノイド / 二次代謝産物 / 代謝設計

Outline of Annual Research Achievements

植物・微生物は様々な有用テルペノイド化合物を生産し、医薬品、芳香剤、エネルギー資源など多岐に亘る需要がある。立体特異的構造をもつため化学合成が困難であり、量産には生物の生合成系を活用する必要がある。放線菌は、構造多様性を持つ有用二次代謝物を高生産する能力を有するためテルペノイド化合物への応用利用が期待されているが、大腸菌や酵母のような実質的な高生産システムの開発には至っていない。本研究では、メバロン酸経路を直接制御する転写制御因子とプロモーターセットを内在する放線菌 (Streptomyces reveromyceticus)を活用し、遺伝子発現時期が異なる一次・二次代謝生合成遺伝子の全てを同調的に機能させることにより、テルペノイド高生産に特化した生合成プラットフォームを構築すること、さらに、この基盤を活用し機能未知の遺伝子クラスターから生合成される新規二次代謝産物を取得することを目的とした。実施計画にもとづき、全RNA発現解析を行い、様々な発現パターンを示すプロモーターをフラキノシン(FQ)生合成遺伝子クラスターの転写制御因子に連結し、FQ生産を指標（褐色コロニーとなるため生産判断が容易）に二次代謝生合成とのリンクを検証した。その結果、当初の予想に反し、恒常的に高発現しているプロモーターを連結した場合には効率的な代謝リンクを達成できないことが判明した。そこで、二次元電気泳動により、対数増殖期、定常状態で発現しているタンパク質発現を経時的に解析し、その挙動をカタログ化した。さらに、一次・二次代謝リンクに関わる内在プロモーター探索を行い、ボツリオコッセン生産を検討したところ、約0.2g/Lの生産量を達成することに成功した。また、本システムに人工合成DNAを用いて作成したテルペノイド環化酵素を導入することによって、二次代謝物生産に成功した。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Kentucky(米国)
• [Journal Article] β-carboline biomediators induce reveromycin production in Streptomyces sp. SN-593. (2019)
  • Author(s): Panthee S., Takahashi S.*, Hayashi T., Shimizu T, and Osada H.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 9 Issue: 1 Pages: 5802-5802
  • DOI: 10.1038/s41598-019-42268-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Pentaminomycins A and B, hydroxyarginine-containing cyclic pentapeptides from Streptomyces sp. RK88-1441. (2018)
  • Author(s): Jang J.-P., Hwang G.J., Kwon M.C., Ryoo I.-J., Jang M., Takahashi S., Ko S.K., Osada H., Jang J.H., and Ahn J.S.
  • Journal Title: J. Nat. Prod. Volume: 81 Issue: 4 Pages: 806-810
  • DOI: 10.1021/acs.jnatprod.7b00882
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Aturanosides A and B, glycosylated anthraquinones with antiangiogenic activity from a soil-derived Streptomyces species. (2018)
  • Author(s): Jang J.-P., Hwang G.J., Jang M., Takahashi S., Ko S.K., Osada H., Jang J.H., and Ahn J.S.
  • Journal Title: J. Nat. Prod. Volume: 81 Issue: 9 Pages: 2004-2009
  • DOI: 10.1021/acs.jnatprod.8b00307
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Control of the stereochemical course of [4+2] cycloaddition during trans-decalin formation by Fsa2-family enzymes (2018)
  • Author(s): Kato N, Nogawa T, Takita R, Kinugasa K, Kanai M, Uchiyama M, Osada H, Takahashi S
  • Journal Title: Angew Chem Int Ed Engl Volume: 57 Issue: 31 Pages: 9754-9758
  • DOI: 10.1002/anie.201805050
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Catenulisporolides, glycosylated triene macrolides from the chemically underexploited actinomycete Catenulispora species. (2018)
  • Author(s): Son S., Hong Y.S., Futamura Y., Jang M., Lee J.K., Heo K.T., Ko S.K., Lee J.S., Takahashi S., Osada H., Jang J.H., Ahn J.S.
  • Journal Title: Org. Lett. Volume: 20 Issue: 22 Pages: 7234-7238
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.8b03160
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Biosynthesis of Quinolidomicin, the Largest Known Macrolide of Terrestrial Origin: Identification and Heterologous Expression of a Biosynthetic Gene Cluster over 200 kb (2018)
  • Author(s): Hashimoto Takuya、Hashimoto Junko、Kozone Ikuko、Amagai Keita、Kawahara Teppei、Takahashi Shunji、Ikeda Haruo、Shin-ya Kazuo
  • Journal Title: Organic Letters Volume: 20 Issue: 24 Pages: 7996-7999
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.8b03570
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Kinanthraquinone, a new anthraquinone carboxamide isolated from Streptomyces reveromyceticus SN-593-44. (2018)
  • Author(s): Takagi H., Nogawa T., Futamura Y., Takahashi S., Osada H.
  • Journal Title: J. Antibiot. Volume: 71 Pages: 480-482
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of a terpenoid-production platform in Streptomyces reveromyceticus SN-593 (2017)
  • Author(s): Khalid A、Takagi H、Panthee S、Muroi M、Chappell J、Osada H、Takahashi S
  • Journal Title: ACS Synthetic Biology Volume: 6 Issue: 12 Pages: 2339-2349
  • DOI: 10.1021/acssynbio.7b00249
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Novel squalene-producing thraustochytrids found in mangrove water. (2017)
  • Author(s): Otagiri M., Khalid A., Moriya S., Osada H., Takahashi S.
  • Journal Title: Biosci Biotechnol Biochem. Volume: 81 Issue: 10 Pages: 2034-2037
  • DOI: 10.1080/09168451.2017.1359485
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Development of a terpenoid-production platform in Streptomyces reveromyceticus SN-593 (2019)
  • Author(s): Shunji Takahashi
  • Organizer: 2nd China-Japan Joint Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] リベロマイシン生合成に関わるRevKの結晶構造解析 (2019)
  • Author(s): 奥村英夫、鬼頭奈央子、佐藤裕美、熊坂崇、長田裕之、高橋俊二
  • Organizer: 農芸化学会
• [Presentation] リベロマイシン生合成に関わるサクシニル化酵素群の相互作用解析 (2019)
  • Author(s): 鬼頭奈央子、佐藤裕美、奥村英夫、熊坂崇、長田裕之、高橋俊二
  • Organizer: 農芸化学会
• [Presentation] Crystal Structures of an Indole Prenyltransferase, IptA: Implications for Substrate Tolerance and Its Expansion (2018)
  • Author(s): 西本一希、日野智也、高木 海、佐藤裕美、高橋俊二、永野真吾
  • Organizer: 24th Conference on Isoprenoids
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] リベロマイシン生合成に関わるサクシニル化酵素群の機能解析 (2018)
  • Author(s): 鬼頭奈央子、佐藤裕美、奥村英夫、熊坂崇、長田裕之、高橋俊二
  • Organizer: 放線菌学会
• [Presentation] Kinanthraquinone生合成遺伝子クラスターの解析 (2018)
  • Author(s): 高尾 理沙、鬼頭 奈央子、高木 海、野川 俊彦、長田 裕之、高橋 俊二
  • Organizer: 放線菌学会
• [Presentation] 新規アントラキノンkinanthraquinoneの同定と生物活性評価 (2018)
  • Author(s): 髙木 海、野川俊彦、二村友史、長田裕之、高橋俊二
  • Organizer: 農芸化学会
• [Presentation] 立体選択的デカリン形成を担うFsa2ファミリーDiels-Alderaseの機能解析 (2018)
  • Author(s): 加藤直樹、野川俊彦、衣笠清美、高橋俊二、長田裕之
  • Organizer: 農芸化学会
• [Presentation] リベロマイシン生合成に関わるサクシニル化酵素群の機能解析 (2018)
  • Author(s): 鬼頭奈央子、高橋俊二、佐藤裕美、奥村英夫、熊坂崇、長田裕之
  • Organizer: 農芸化学会
• [Presentation] 糸状菌Pyrenochaetopsis sp. RK10-F058より単離した新規デカリン骨格含有二次代謝産物wakodecaline Cの構造 (2018)
  • Author(s): 野川俊彦、加藤直樹、清水猛、岡野亜紀子、二村友史、高橋俊二、長田裕之
  • Organizer: 農芸化学会
• [Presentation] リベロマイシン生合成に関わるRevMの機能解析 (2017)
  • Author(s): 鬼頭奈央子、高橋俊二、佐藤裕美、奥村英夫、熊坂崇、長田裕之
  • Organizer: 放線菌学会
• [Remarks] 天然物生合成研究ユニット
  • URL: http://www.csrs.riken.jp/jp/labs/npbu/index.html