Action mechanism of CRISPR-Cas9

• Project Area: Neo-taxonomy of noncoding RNAs
• Project/Area Number: 17H05592
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 西増 弘志 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (00467044)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000); Fiscal Year 2018: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2017: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
• Keywords: CRISPR / 結晶構造 / CRISPR-Cas / 高速AFM / 蛋白質 / 核酸

Outline of Annual Research Achievements

CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し、ガイドRNAと相補的な2本鎖DNAを選択的に切断する。したがって、Cas9を用いることにより、ゲノムDNAの狙った位置を切断し、その周辺の塩基配列を改変すること（ゲノム編集）が可能である。しかし、Cas9が標的DNAを認識するためには、ガイドRNAと標的DNAとの間の相補性にくわえ、PAMとよばれる特定の塩基配列が必要である。ゲノム編集に利用されているS. pyogenes由来Cas9（SpCas9）はNGG（Nは任意の塩基）という塩基配列をPAMとして必要とするため、ゲノム編集の適用範囲には制限が存在していた。そこで、SpCas9に7つのアミノ酸変異を導入することにより、NGGにくわえ、NGA、NGT、NGCをPAMとして認識するCas9改変体（SpCas9-NG）を作製した。SpCas9またはSpCas9-NGとガイドRNAをヒト培養細胞に発現させ、NGA、NGT、NGG、または、NGCをPAMとしてもつ標的部位への変異の導入を調べた。SpCas9はNGGをPAMとしてもつ標的部位に効率よく変異を誘導した一方、NGTおよびNGCをPAMとしてもつ標的部位には変異を誘導しなかった。SpCas9と対照的に、SpCas9-NGはNGGだけでなくNGHをPAMとしてもつ標的部位に変異を誘導した。さらに、SpCas9-NG（D10A変異体）とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質（Target-AID-NG）をヒト培養細胞に発現させ、NGA、NGT、NGG、または、NGCをPAMとしてもつ標的部位の塩基置換を調べた結果、Target-AID-NGはNGNをPAMとしてもつ標的部位に塩基置換を誘導することが明らかになった。以上の結果から、SpCas9-NGを利用することにより、ゲノム編集の適用範囲を従来の約4倍に拡張することに成功した。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Broad Institute(米国)
• [Int'l Joint Research] Broad Institute(米国)
• [Journal Article] Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM (2018)
  • Author(s): Endo Masaki、Mikami Masafumi、Endo Akira、Kaya Hidetaka、Itoh Takeshi、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu、Toki Seiichi
  • Journal Title: Nature Plants Volume: 5 Issue: 1 Pages: 14-17
  • DOI: 10.1038/s41477-018-0321-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II?associated methyltransferase (2018)
  • Author(s): Akichika Shinichiro、Hirano Seiichi、Shichino Yuichi、Suzuki Takeo、Nishimasu Hiroshi、Ishitani Ryuichiro、Sugita Ai、Hirose Yutaka、Iwasaki Shintaro、Nureki Osamu、Suzuki Tsutomu
  • Journal Title: Science Volume: 363 Issue: 363 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1126/science.aav0080
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural insights into cGAMP degradation by Ecto-nucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 (2018)
  • Author(s): Kato Kazuki、Nishimasu Hiroshi、Oikawa Daisuke、Hirano Seiichi、Hirano Hisato、Kasuya Go、Ishitani Ryuichiro、Tokunaga Fuminori、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 9 Issue: 1 Pages: 4424-4424
  • DOI: 10.1038/s41467-018-06922-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space (2018)
  • Author(s): Nishimasu Hiroshi、Shi Xi、Ishiguro Soh、Gao Linyi、Hirano Seiichi、Okazaki Sae、Noda Taichi、Abudayyeh Omar O.、Gootenberg Jonathan S.、Mori Hideto、Oura Seiya、Holmes Benjamin、Tanaka Mamoru、Seki Motoaki、Hirano Hisato、Aburatani Hiroyuki、Ishitani Ryuichiro、Ikawa Masahito、Yachie Nozomu、Zhang Feng、Nureki Osamu
  • Journal Title: Science Volume: 361 Issue: 6408 Pages: 1259-1262
  • DOI: 10.1126/science.aas9129
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy (2017)
  • Author(s): Shibata Mikihiro、Nishimasu Hiroshi、Kodera Noriyuki、Hirano Seiichi、Ando Toshio、Uchihashi Takayuki、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 8 Issue: 1 Pages: 1430-1430
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01466-8
  • NAID: 120006374160
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural Basis for the Canonical and Non-canonical PAM Recognition by CRISPR-Cpf1 (2017)
  • Author(s): Yamano Takashi、Zetsche Bernd、Ishitani Ryuichiro、Zhang Feng、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 67 Issue: 4 Pages: 633-645
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2017.06.035
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural Basis for the Altered PAM Recognition by Engineered CRISPR-Cpf1 (2017)
  • Author(s): Nishimasu Hiroshi、Yamano Takashi、Gao Linyi、Zhang Feng、Ishitani Ryuichiro、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 67 Issue: 1 Pages: 139-147
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2017.04.019
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities (2017)
  • Author(s): Gao Linyi、Cox David B T、Yan Winston X、Manteiga John C、Schneider Martin W、Yamano Takashi、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu、Crosetto Nicola、Zhang Feng
  • Journal Title: Nature Biotechnology Volume: 35 Issue: 8 Pages: 789-792
  • DOI: 10.1038/nbt.3900
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Engineered CRISPR-Cas9 recognizing a single guanine PAM (2018)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu
  • Organizer: 日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] 立体構造に基づくCRISPR-Cas9の分子改変 (2018)
  • Author(s): 西増 弘志
  • Organizer: MBSJ2018
  • Invited
• [Presentation] Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy (2017)
  • Author(s): Nishimasu Hiroshi、Shibata Mikihiro、Kodera Noriyuki、Hirano Seiichi、Ando Toshio、Uchihashi Takayuki、Nureki Osamu
  • Organizer: CRISPR2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CRISPR-Cas9の結晶構造と機能改変 (2017)
  • Author(s): 西増 弘志
  • Organizer: 千里ライフサイエンスセミナー
  • Invited
• [Presentation] CRISPR-Cas9の結晶構造と機能改変 (2017)
  • Author(s): 西増 弘志
  • Organizer: 蛋白研セミナー
  • Invited
• [Presentation] CRISPR-Cas9の結晶構造と機能改変 (2017)
  • Author(s): 西増 弘志、濡木 理
  • Organizer: 日本結晶学会年会
  • Invited
• [Presentation] Structure, Dynamics & Engineering of CRISPR-Cas9 (2017)
  • Author(s): Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Organizer: ConBio2017
  • Invited
• [Remarks] ゲノム編集の標的領域を拡張！
  • URL: https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2018/6021/
• [Remarks] CRISPR-Cas9がDNAを切断する瞬間の撮影に成功！
  • URL: https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2017/5629/