Developing a translation system that has a variable speed of the nascent chain elongation

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 17H05656
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (40311518)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2018: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2017: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: 新生鎖の合成 / 合成速度の調節 / リボソームPストーク / タンパク質工学 / X線構造解析 / 合成速度の調製 / リボソームＰストーク / Ｘ線構造解析 / 生物学 / 生物科学 / 構造生物化学 / 分子生物学

Outline of Annual Research Achievements

リボソームによる新生鎖合成のメカニズムが明らかになってきた現在，その得られた情報をもとに，新生鎖合成を自在に制御できるような次世代型新生鎖合成システムの創成が期待されている．本研究は，大腸菌をモデルとして，新生鎖合成に必要なエネルギーを供給するGTPaseを運搬するストークの足場タンパク質L10の改変によって真核の性質を持つキメラ型L10を作製し，それに結合するL12二量体（バクテリア）又はP1二量体（真核型）の個数を調節することで，新生鎖の合成速度を人工的に数段階調節できるタンパク質合成システムを創出することを試みる．その目的に達成するため，平成29年度に得られた結果に基づいて研究を進めた．
H29年度に作製したキメラL/PストックL10(CH1)P0(CH2)を用いて，L12，およびP1との結合をさらに再現性を確認し，翻訳GTPase因子である古細菌伸長因子aEF-2との結合実験へ進めた．その結果，キメラL/Pストックが古細菌伸長因子aEF-2との結合が見られた．
次に，キメラL/Pストックが翻訳速度に対する影響があるかかとうかを確認するため，他の種類のL10変異体, 例えば，L10(CH2P0(CH1)の作製より，キメラL/Pストックの翻訳速度をin vitroで調べることを先に進めた．in vitroの調べは，東大の網藏和晃助教の協力をいただき，研究協力者である内海教授が作製したL11欠損株を用いて，大腸菌の無細胞発現系を利用することにした．コントロールとして， WTのL10-L12L12-L12L12の5量体も必要であり，大量調製を行った．L10-L12L12-L12L12の調製もキメラL/Pストックを作成した場合と同様にL12と共発現系を用いて，精製には尿素を使用する必要がるので，refolding-reconstruct方法で大量調製ができた．それらのサンプルを用いて，大腸菌の無細胞発現系で調べたところ，キメラL/Pストックが機能することが分かった．

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The C-terminal helix of ribosomal P stalk recognizes a hydrophobic groove of elongation factor 2 in a novel fashion (2018)
  • Author(s): Tanzawa Takehito、Kato Koji、Girodat Dylan、Ose Toyoyuki、Kumakura Yuki、Wieden Hans-Joachim、Uchiumi Toshio、Tanaka Isao、Yao Min
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 46 Issue: 6 Pages: 3232-3244
  • DOI: 10.1093/nar/gky115
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Study on the tRNA channeling mechanism of transsulfursome for Cys-tRNACys synthesis in indirect pathway (2018)
  • Author(s): Satoru Kono, MeirongChen, Yume Kubo, Koji Kato, Min Yao
  • Organizer: 「新生鎖の生物学」合同国際シンポジウム
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Attempting to adjust the elongation speed of the nascent cahin elongation on ribosome (2018)
  • Author(s): 姚閔
  • Organizer: 「新生鎖の生物学」合同国際シンポジウム
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 真核生物リボソームの生合成因子のマルチ機能の解析 (2018)
  • Author(s): 姚閔
  • Organizer: 第5回Ribosome Meeting
• [Presentation] 中性子回折によるアミド基転移酵素GatCABのアンモニア輸送機構 (2018)
  • Author(s): 姚閔
  • Organizer: 平成30年度第1回構造生物学研究会
  • Invited
• [Presentation] Attempting to adjust the elongation speed of protein synthesis (2017)
  • Author(s): Min Yao, Takehito Tanzawa, and Toshio Uchiumi
  • Organizer: 新学術領域研究「新生鎖の生物学」国際シンポジウム
• [Presentation] リボソームへのＧＴＰａｓｅ運搬機構の解明 (2017)
  • Author(s): 丹澤豪人
  • Organizer: 新学術領域研究 「新生鎖の生物学」若手ワークショップ
• [Presentation] 新生鎖合成速度の改変への試み (2017)
  • Author(s): 姚閔、丹澤豪人、内海利男
  • Organizer: 新領域「新生鎖の生物学」Ｈ29年度全体班会議
• [Presentation] リボソームへのGTPase運搬メカニズムの解明 (2017)
  • Author(s): 丹澤豪人、加藤公児、尾瀬農之、田中良和、内海利男、田中勲、姚閔
  • Organizer: 新領域「新生鎖の生物学」Ｈ29年度全体班会議
• [Remarks] 研究室ホームページ
  • URL: http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/
• [Remarks] 研究室のホームページ
  • URL: http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/
• [Remarks] 新生鎖の合成についての研究
  • URL: http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/Research/TRLFs.html