Analysis of the nascent peptide-ribosome complex during amino acid starvation.

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 17H05671
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 山下 暁朗 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (20405020)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2018: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2017: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: 新生鎖 / アミノ酸飢餓 / NMD / SMG1 / TRAP法 / 遺伝子 / 核酸 / シグナル伝達 / 生体分子 / ストレス / 翻訳 / リボソーム

Outline of Annual Research Achievements

生物は栄養が不足した際に、消費を抑えて、飢餓による細胞死を防ぐ仕組みを持つ。こうした仕組みは出芽酵母からヒトを含む高等動物にまで共通であり、mTORC1 不活性化とGCN2 活性化により翻訳が抑制される。しかし、哺乳動物におけるGCN2活性化機構や飢餓アミノ酸をコードするコドン上で停滞したリボソーム上の新生鎖の運命についてはほとんど解析が進んでいない。本研究では、アミノ酸飢餓時に飢餓アミノ酸コドン上で停滞したリボソーム上の新生鎖を簡便に解析するレポーターを新たに作成し、mTORC1やGCN2などのシグナル経路と新生鎖の運命の関わりの解明を目指した。
GCN2制御機構の解析においては、GCN2の活性を制御する新規因子を同定し、分子機構の解明に成功した。一方、当初計画していたNanoLucを用いたレポーターにおいて、全リジンのアルギニンへの変異、全アルギニンのリジンへの変異に成功した。しかし、それ以外のアミノ酸変異では、十分なNanoLuc活性が得られなかった。そこで、NanoLucのSplit peptideであるHiBitを改変したmHiBit を樹立し、安定なT4 Lysozymeと融合させたレポーターを構築した。また、ribosomeの簡易精製のためのeGFP-rpS10a融合タンパク質を安定発現する細胞株を樹立し、ribosomeに結合するmRNAを解析する方法についても導入を進め、次世代シークエンス解析により、ロイシン飢餓依存的翻訳変動を解析した。その結果、4時間のロイシン飢餓では、mRNAについてribosomeとの結合に変化が生じず、uORFを有する遺伝子を含む、一部のmRNAについてのみリボソームとの結合が上昇することが明らかになった。ロイシン以外の様々なアミノ酸について、1種類の飢餓では、翻訳抑制が起きていないことをレポーターを用いた解析により明らかとした。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Effects of rikkunshito on renal fibrosis and inflammation in angiotensin II-infused mice (2019)
  • Author(s): Azushima Kengo、Uneda Kazushi、Wakui Hiromichi、Ohki Kohji、Haruhara Kotaro、Kobayashi Ryu、Haku Sona、Kinguchi Sho、Yamaji Takahiro、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Yamashita Akio、Tamura Kouichi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 6201-6201
  • DOI: 10.1038/s41598-019-42657-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Effects of ATRAP in Renal Proximal Tubules on Angiotensin‐Dependent Hypertension (2019)
  • Author(s): Kinguchi Sho、Wakui Hiromichi、Azushima Kengo、Haruhara Kotaro、Koguchi Tomoyuki、Ohki Kohji、Uneda Kazushi、Matsuda Miyuki、Haku Sona、Yamaji Takahiro、Yamada Takayuki、Kobayashi Ryu、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Yamashita Akio、Fujikawa Tetsuya、Tamura Kouichi
  • Journal Title: Journal of the American Heart Association Volume: 8 Issue: 8
  • DOI: 10.1161/jaha.119.012395
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Environmental stresses suppress nonsense-mediated mRNA decay (NMD) and affect cells by stabilizing NMD-targeted gene expression (2019)
  • Author(s): Usuki Fusako、Yamashita Akio、Fujimura Masatake
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 1279-1279
  • DOI: 10.1038/s41598-018-38015-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Early Enhanced Leucine-Rich α-2-Glycoprotein-1 Expression in Glomerular Endothelial Cells of Type 2 Diabetic Nephropathy Model Mice (2018)
  • Author(s): haku Sona、Wakui Hiromichi、Azushima Kengo、Haruhara Kotaro、Kinguchi Sho、Ohki Kohji、Uneda Kazushi、Kobayashi Ryu、Matsuda Miyuki、Yamaji Takahiro、Yamada Takayuki、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Yamashita Akio、Ohashi Kenichi、Tamura Kouichi
  • Journal Title: BioMed Research International Volume: 2018 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1155/2018/2817045
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Angiotensin II Type 1 Receptor-associated Protein Inhibits Angiotensin II-induced Insulin Resistance with Suppression of Oxidative Stress in Skeletal Muscle Tissue (2018)
  • Author(s): Ohki Kohji、Wakui Hiromichi、Kishio Nozomu、Azushima Kengo、Uneda Kazushi、Haku Sona、Kobayashi Ryu、Haruhara Kotaro、Kinguchi Sho、Yamaji Takahiro、Yamada Takayuki、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Toya Yoshiyuki、Yamashita Akio、Imajo Kento、Nakajima Atsushi、Kato Ikuma、Ohashi Kenichi、Tamura Kouichi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Issue: 1 Pages: 2846-2846
  • DOI: 10.1038/s41598-018-21270-8
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Angiotensin receptor-binding molecule in leukocytes in association with the systemic and leukocyte inflammatory profile (2018)
  • Author(s): Haruhara Kotaro、Wakui Hiromichi、Azushima Kengo、Kurotaki Daisuke、Kawase Wataru、Uneda Kazushi、Haku Sona、Kobayashi Ryu、Ohki Kohji、Kinguchi Sho、Ohsawa Masato、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Matsuda Miyuki、Yamashita Akio、Nakajima Hideaki、Tamura Tomohiko、Tsuboi Nobuo、Yokoo Takashi、Tamura Kouichi
  • Journal Title: Atherosclerosis Volume: 269 Pages: 236-244
  • DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2018.01.013
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Endoplasmic reticulum stress preconditioning modifies intracellular mercury content by upregulating membrane transporters (2017)
  • Author(s): Usuki Fusako、Fujimura Masatake、Yamashita Akio
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 7 Issue: 1 Pages: 12390-12390
  • DOI: 10.1038/s41598-017-09435-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Angiotensin II Type 1 Receptor‐Associated Protein Regulates Kidney Aging and Lifespan Independent of Angiotensin (2017)
  • Author(s): Uneda Kazushi、Wakui Hiromichi、Maeda Akinobu、Azushima Kengo、Kobayashi Ryu、Haku Sona、Ohki Kohji、Haruhara Kotaro、Kinguchi Sho、Matsuda Miyuki、Ohsawa Masato、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Toya Yoshiyuki、Atobe Yoshitoshi、Yamashita Akio、Umemura Satoshi、Tamura Kouichi
  • Journal Title: Journal of the American Heart Association Volume: 6 Issue: 8
  • DOI: 10.1161/jaha.117.006120
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ATRAP Expression in Brown Adipose Tissue Does Not Influence the Development of Diet-Induced Metabolic Disorders in Mice (2017)
  • Author(s): Wakui H, Ohki K, Azushima K, Uneda K, Haku S, Kobayashi R, Haruhara K, Kinguchi S, Matsuda M, Ohsawa M, Maeda A, Minegishi S, Ishigami T, Toya Y, Yamashita A, Umemura S, Tamura K
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 18 Issue: 3 Pages: 676-676
  • DOI: 10.3390/ijms18030676
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Adipocyte-Specific Enhancement of Angiotensin II Type 1 Receptor-Associated Protein Ameliorates Diet-Induced Visceral Obesity and Insulin Resistance. (2017)
  • Author(s): Azushima K, Ohki K, Wakui H, Uneda K, Haku S, Kobayashi R, Haruhara K, Kinguchi S, Matsuda M, Maeda A, Toya Y, Yamashita A, Umemura S, Tamura K.
  • Journal Title: J Am Heart Assoc. Volume: 6 Issue: 3
  • DOI: 10.1161/jaha.116.004488
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] An angiotensin II type 1 receptor binding molecule has a critical role in hypertension in a chronic kidney disease model. (2017)
  • Author(s): Kobayashi R, Wakui H, Azushima K, Uneda K, Haku S, Ohki K, Haruhara K, Kinguchi S, Matsuda M, Ohsawa M, Toya Y, Nishiyama A, Yamashita A, Tanabe K, Maeshima Y, Umemura S, Tamura K.
  • Journal Title: Kidney Int. Volume: 91 Issue: 5 Pages: 1115-1125
  • DOI: 10.1016/j.kint.2016.10.035
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Translational control of mRNAs by 3'-Untranslated region binding proteins (2017)
  • Author(s): Yamashita Akio、Takeuchi Osamu
  • Journal Title: BMB Reports Volume: 50 Issue: 4 Pages: 194-200
  • DOI: 10.5483/bmbrep.2017.50.4.040
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] PI3 kinase様タンパク質リン酸化酵素SMG1によるアミノ酸飢餓応答依存的遺伝子発現制御. (2018)
  • Author(s): 山下 暁朗
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] PI3 kinase様タンパク質リン酸化酵素SMG1による酸化ストレス応答制御：SMG1によるNRF2活性制御機構の解析. (2018)
  • Author(s): 藤川 由美子, 山下 暁朗, 大貫 哲男, 鈴木 香絵, 青柳 杏子, 黒澤 瞳, 廣瀬 博子, 永井 陽子, 上村 博司, 吉田 稔, 髙橋 秀尚, 大野 茂男
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] SMG1によるNMDとストレス応答統御機構の解析. (2018)
  • Author(s): 山下 暁朗
  • Organizer: 第7回さきがけ「RNAと生体機能」研究会
• [Presentation] PI3-kinase related kinase SMG1 and DNA-PKcs directly phosphorylate and regulate NRF2 in response to oxidative stress. (2018)
  • Author(s): 山下 暁朗
  • Organizer: 「新生鎖の生物学」合同国際シンポジウム Proteins : from the Cradle to the Grave
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] PI3 kinase様タンパク質リン酸化酵素SMG1による新たな転写後制御機構の発見 (2017)
  • Author(s): 山下 暁朗, 佐藤 由典, 黒澤 瞳, 廣瀬 博子, 青柳 杏子, 永井 陽子, 大野 茂男
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会
• [Presentation] PI3 kinase様タンパク質リン酸化酵素SMG1阻害による抗腫瘍効果の解析 (2017)
  • Author(s): 藤川 由美子, 山下 暁朗, 大貫 哲男, 鈴木 香絵, 青柳 杏子, 黒澤 瞳, 廣瀬 博子, 永井 陽子, 上村 博司, 吉田 稔, 大野 茂男
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会
• [Presentation] 新規aPKC結合タンパクp200による上皮細胞極性の調節機構 (2017)
  • Author(s): 佐々木 和教, 麹谷 典子, 廣瀬 博子, 吉濱 陽平, 高柳 亜由美, 山下 暁朗, 平野 久, 大野 茂男
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会