mRNAディスプレイ法による翻訳アレスト配列の大規模探索

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 17H05674
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 土居 信英 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (50327673)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2018: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2017: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: 蛋白質 / 発現制御 / 生体生命情報学 / バイオテクノロジー / プロテオーム

Outline of Annual Research Achievements

（１）大腸菌の翻訳アレスト配列の大規模探索および機能解析
前年度に試験管内でアレストを示した大腸菌遺伝子の中に、従来のリボソームプロファイリングやiNP法を用いた細胞内の実験ではアレストを示していなかったものが存在する理由の１つとして、試験管内には存在しないアレスト解除因子が大腸菌内に存在している可能性が考えられた。そこで、得られた各遺伝子の機能と関連する制御因子を推定し、その存在／非存在下で無細胞翻訳反応を行いアレスト活性を測定した結果、試験管内でアレストを制御している可能性のある因子を見出すことができた。また、もう１つの原因として、アレスト配列がピューロマイシン感受性か耐性かの違いで差がついている可能性を検証するために、iNP法でピューロマイシン感受性が定量化されている遺伝子の情報を抽出し、今回の濃縮効率との関係性を調べた結果、ピューロマイシンに感受性の高い翻訳アレスト配列に相当する部分配列においてより強く濃縮されている傾向が見られた。
さらに、以前にランダム配列ライブラリーから８ラウンドの試験管内選択をおこなったサンプルについて、次世代シークエンサーによる大規模な配列解析をおこなった。現在、得られた膨大な情報を解析して、大腸菌におけるアレストのモチーフ配列の抽出を進めている。
（２）真核生物の翻訳アレスト配列の試験管内選択
前年度に、小麦胚芽抽出液由来の無細胞翻訳系を用いてmRNA-タンパク質連結分子の形成を確認することができたので、この系を用いてランダム配列ライブラリーの試験管内選択をおこなった。その結果、４ラウンドで連結分子の形成が確認されたことから、植物におけるアレスト候補配列の濃縮が示唆された。現在、これらの配列のクローニングおよび配列解読を進めており、今後、植物と原核生物のリボソームに対して翻訳アレストをおこす配列の特徴の比較解析をおこなう予定である。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] In vitro transcription-translation using bacterial genome as a template to reconstitute intracellular profile (2017)
  • Author(s): Fujiwara Kei、Sawamura Tsunehito、Niwa Tatsuya、Deyama Tatsuki、Nomura Shin-ichiro M.、Taguchi Hideki、Doi Nobuhide
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 45 Issue: 19 Pages: 11449-11458
  • DOI: 10.1093/nar/gkx776
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] STALL-seq: selection of translational arrest sequences from a large E. coli genome-fragment library (2018)
  • Author(s): Hamano, T., Nagumo, Y., Chadani, Y., Tokunaga, M., Fujiwara, K., Taguchi, H., Doi, N.
  • Organizer: International Symposium on "Proteins; from the Cradle to the Grave"
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In vitro selection of eukaryotic translational arrest sequences from a random-sequence library using mRNA display (2018)
  • Author(s): Umehara, T., Hamano, T., Chadani, Y., Fujiwara, K., Taguchi, H., Doi, N.
  • Organizer: International Symposium on "Proteins; from the Cradle to the Grave"
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] STALL-seq法による大腸菌新規翻訳アレスト遺伝子の大規模探索と機能解析 (2018)
  • Author(s): 濱野理，南雲優，茶谷悠平，徳永真由子，藤原慶，田口英樹，土居信英
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 真核生物由来の翻訳停止配列を試験管内で大規模に探索する手法の開発 (2018)
  • Author(s): 梅原智文，濱野理，茶谷悠平，藤原慶，田口英樹，土居信英
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Large-scale identification of E. coli translational arrest sequences using mRNA display. (2017)
  • Author(s): Hamano, T., Nagumo, Y., Chadani, Y., Tokunaga, M., Fujiwara, K., Taguchi, H., Doi, N.
  • Organizer: International Symposium on Protein Quality Control
  • Int'l Joint Research