Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
１．緑色イオウ細菌のRieske/cyt b型シトクロム複合体の可溶化・精製の検討1) 界面活性剤の再検討： これまでのSM-1200による可溶化に加え、β-OG、β-DDM、およびβ-OGとコール酸ナトリウムの混合溶液 (β-OG/コール酸ナトリウム)による可溶化を試みた。電気泳動により目的タンパク質を確認したところ、β-DDMが最も効率よく可溶化できていることが判明した。2) 標品調製に用いる株の再検討：cyt bおよびRieske ISPのN末端にHis-tagを付加したコンストラクト（それぞれHis-bおよびHis-R）について検討した。可溶化後のヘムbの含量を差吸収スペクトルが見積もったところ、His-RよりもHis-bの方が含まれているヘムb含量が多いことが分かった。しかしながら可溶化後の標品に含まれているヘムb量に比べ、Ni樹脂からの溶出画分に含まれているヘムb量が極端に少なかった。好気条件下での一連の操作では、非共有結合しているヘムbが不安定で容易に遊離すると推測された。今後は嫌気的条件下での可溶化、精製を試みる必要がある。２．緑色イオウ細菌のRieskeタンパク/ CT0073（cyt c-556）の相互作用解析1) NMR測定による相互作用解析： 15N-Rieske-sol（Rieske ISPの可溶性ドメイン）と14N-cyt c-556を準備し、還元型15N-Rieske-solと酸化型14N-cyt c-556を混合することでピークシフトが観測された。このことは電子伝達反応にともなう複合体形成を意味する。2) 相互作用部位の同定：上記の動きを示すピークがどのアミノ酸残基であるかを明らかにするため、二重標識した13C, 15N-Rieske-solの大量発現、精製を行った。現在、シグナルの帰属を進めている。
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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The Journal of Physical Chemistry B
Volume: 122 Issue: 9 Pages: 2536-2543
10.1021/acs.jpcb.7b12171
http://www.bio.sci.osaka-u.ac.jp/~ohoka/publications.html
