新規リシール細胞技術を用いた複数タンパク質・膜不透過性中分子の細胞内導入法の開発

• Project Area: Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
• Project/Area Number: 17H05870
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 村田 昌之 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (50212254)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥13,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000、Indirect Cost: ¥3,000,000); Fiscal Year 2018: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2017: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: セミインタクト細胞リシール法 / 中分子導入法 / 病態モデル細胞 / 細胞内操作技術 / リシール細胞技術 / セミインタクト細胞 / 細胞内物質導入技術

Outline of Annual Research Achievements

われわれは、細胞膜を透過性にして細胞質交換を可能にした「セミインタクト細胞リシール技術」を開発し、細胞内への生体物質導入法や導入した物質の様々な細胞内生命現象への影響などを光学顕微鏡下で可視化解析するマルチスケール解析を中心とした様々な解析システムを構築している。この細胞内操作技術は、多種類のタンパク質成分や膜不透過性の(天然)化合物・低分子化合物・中分子(特殊機能ペプチドや機能性核酸など)を、同時に定量的に細胞内に導入することが可能であり、かつオルガネラや細胞骨格の構造とトポロジーが保持されているため、導入されたタンパク質（群）の様々な動的平衡状態を「真の細胞環境内に近い状態で」計測できる。今年度は、研究計画に沿って、2種類の細胞内導入法(SLO型及びLLO型リシール法)を構築し、その最適化と性能比較を行った。その結果、2種類のリシール法を用い、膜不透過性の低分子・中分子・タンパク質・細胞質など、広いサイズ範囲の物質を、細胞質依存的に(SLO型)、細胞質非依存的に(LLO型)に細胞内に導入するシステムを完成させることができた。また、導入した物質の細胞機能に与える影響を生化学的に検定すル様々な生化学的・細胞生物学的手法の加え、導入物質によって影響を受ける細胞の「状態」変化を、細胞内のタンパク質分子ネットワーク(正確には、共変動分子ネットワーク)として記述するための解析手法(マルチスケール解析法)の応用環境の整備も行った。さらに、SLO型リシール法を用いて作成した、正常または病態モデル細胞に対し、LLO型リシール法を使って様々な低分子・中分子を追加導入することで、低分子・中分子を病態環境でスクリーニングし構造・機能解析するシステムも構築した。これら知見を基に、2種類のリシール法の性能・特長を比較し、幾つかの和文・英文の総説として発表した。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Phosphatidylinositol-3-phosphate-mediated actin domain formation linked to DNA synthesis upon insulin treatment in rat hepatoma-derived H4IIEC3 cells (2019)
  • Author(s): Kano, F., Murata, M.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Mol. Cell Res. Volume: 1866 Issue: 5 Pages: 793-805
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2019.02.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Changes in the asymmetric distribution of cholesterol in the plasma membrane influence streptolysin O pore formation (2019)
  • Author(s): Ogasawara, F., Kano, F., Murata, M., Kimura, Y., Kioka, N., Ueda, K
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 9 Issue: 1 Pages: 4548-4548
  • DOI: 10.1038/s41598-019-39973-x
  • NAID: 120006644065
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The cell resealing technique for manipulating, visualizing, and elucidating molecular functions in living cells. (2019)
  • Author(s): Kunishige, R., Kano, F., Murata, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Acta (General Subjects) Volume: 印刷中 Issue: 2 Pages: 129329-129329
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.03.015
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-molecule diffusion-based estimation of ligand effects on G protein?coupled receptors (2018)
  • Author(s): Yanagawa Masataka、Hiroshima Michio、Togashi Yuichi、Abe Mitsuhiro、Yamashita Takahiro、Shichida Yoshinori、Murata Masayuki、Ueda Masahiro、Sako Yasushi
  • Journal Title: Science Signaling Volume: 11 Issue: 548 Pages: 1-16
  • DOI: 10.1126/scisignal.aao1917
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Exosome-associated Shiga toxin 2 is released from cells and causes severe toxicity in mice (2018)
  • Author(s): Watanabe-Takahashi, M., Yamasaki, S., Murata, M., Kano, F., Motoyama, J., Yamate, J., Omi, J., Sato, W., Ukai, H., Shimasaki, K., Ikegawa, M., Tamura-Nakano, M., Yanoshita, R., Nishino, Y., Miyazawa, A., Natori, Y., Toyama-Sorimachi, N., Nishikawa, N.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 8 Issue: 1 Pages: 10776-10776
  • DOI: 10.1038/s41598-018-29128-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] セミインタクト細胞リシール技術の新展開：「再構成」から「細胞編集」まで (2018)
  • Author(s): 村田昌之、加納ふみ
  • Journal Title: 生化学 Volume: 90 Pages: 433-443
  • NAID: 40021670407
• [Journal Article] セミインタクト細胞リシール技術を用いた細胞機能解析 (2018)
  • Author(s): 國重莉奈、加納ふみ、村田昌之
  • Journal Title: 生体の科学 Volume: 69 Pages: 247-251
• [Journal Article] セミインタクト細胞リシール技術を用いた糖尿病モデル細胞アレイとその解析法 (2018)
  • Author(s): 加納ふみ、野口誉之、村田昌之
  • Journal Title: 『臓器チップの技術と開発動向』（酒井康行、金森敏幸監修） Volume: - Pages: 222-229
• [Journal Article] LLO-mediated Cell Resealing System for Analyzing Intracellular Activity of Membrane-impermeable Biopharmaceuticals of Mid-sized Molecular Weight (2018)
  • Author(s): Murakami Masataka、Kano Fumi、Murata Masayuki
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Issue: 1 Pages: 1946-1946
  • DOI: 10.1038/s41598-018-20482-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The first successful observation of in-cell NMR signals of DNA and RNA in living human cells (2018)
  • Author(s): Yamaoki Yudai、Kiyoishi Ayaka、Miyake Masayuki、Kano Fumi、Murata Masayuki、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • Journal Title: Phys Chem Chem Phys Volume: 20 Issue: 5 Pages: 2982-2985
  • DOI: 10.1039/c7cp05188c
  • NAID: 130007557810
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Establishment and phenotyping of disease model cells created by cell-resealing technique (2017)
  • Author(s): Kano Fumi、Noguchi Yoshiyuki、Murata Masayuki
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 7 Issue: 1 Pages: 15167-15167
  • DOI: 10.1038/s41598-017-15443-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Single-molecule fluorescence imaging of RalGDS on cell surfaces during signal transduction from Ras to Ral (2017)
  • Author(s): Yoshizawa R, Umeki N, Yanagawa M, Murata M, Sako Y
  • Journal Title: Biophysics and Physicobiology Volume: 14 Issue: 0 Pages: 75-84
  • DOI: 10.2142/biophysico.14.0_75
  • NAID: 130007040995
  • ISSN: 2189-4779
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Pyruvate kinase M1 interacts with A-Raf and inhibits endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by activating MEK1/ERK pathway in mouse insulinoma cells (2017)
  • Author(s): Horiuchi Yuta、Nakatsu Daiki、Kano Fumi、Murata Masayuki
  • Journal Title: Cellular Signalling Volume: 38 Pages: 212-222
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2017.07.017
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Novel prosurvival function of Yip1A in human cervical cancer cells: constitutive activation of the IRE1 and PERK pathways of the unfolded protein response (2017)
  • Author(s): Yuki Taguchi, Yuta Horiuchi, Fumi Kano, Masayuki Murata
  • Journal Title: Cell Death and Disease Volume: 8 Issue: 3 Pages: e2718-e2718
  • DOI: 10.1038/cddis.2017.147
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Patent(Industrial Property Rights)] エクソソームの製造方法及びその製造方法によって得られるエクソソーム (2019)
  • Inventor(s): 加納ふみ、村田昌之、園田雄輝
  • Industrial Property Rights Holder: 東京工業大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2019
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] エクソソームの製造方法及びその製造方法によって得られるエクソソーム (2018)
  • Inventor(s): 加納ふみ、村田昌之、園田雄輝
  • Industrial Property Rights Holder: 東京工業大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2018
  • Acquisition Date: 2018
• [Patent(Industrial Property Rights)] Cas9-gRNA複合体の製造方法、Cas9-gRNA複合体の細胞核内への導入方法、及び細胞内における標的遺伝子の改変方法 (2017)
  • Inventor(s): 村田昌之、加納ふみ、村上真隆
  • Industrial Property Rights Holder: 東京大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2017
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] 導入剤、キット、物質導入方法、及びスクリーニング方法 (2017)
  • Inventor(s): 村田昌之、加納ふみ、村上真隆
  • Industrial Property Rights Holder: 東京大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2017
  • Overseas