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Structure and dynamics study for large molecular protein complex using new stereo-array isotpe labeling amino acids

Publicly Offered Research

Project AreaNovel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
Project/Area Number 17H05877
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Complex systems
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

宮ノ入 洋平  大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (80547521)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2019-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2018: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2017: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
KeywordsNMR / 安定同位体標識 / 蛋白質動態 / 巨大蛋白質複合体 / 芳香族アミノ酸 / 蛋白質 / 動態 / 高圧・極低温測定 / 蛋白質複合体 / 安定同位体 / 立体構造 / 高圧測定
Outline of Annual Research Achievements

本課題では、独自に開発を進めてきた安定同位体標識技術を駆使して、80-1000 kDaの高分子量蛋白質複合体の動態構造を解析する手法を確立することを目指している。
平成30年度は、まず、核緩和過程を極限まで排除した新型SAILアミノ酸をGroEL, GroESおよびGroES-GroEL複合体に導入するため、安定同位体標識パターンの最適化を行った。特に芳香族アミノ酸の芳香環および脂肪族水素を立体特異的かつ高感度に観測するためフェニルアラニン、チロシンおよびヒスチジンを対象とした。さらに、ロイシンやバリンのメチル基水素についても最適化を行った。例えば、フェニルアラニンのδ位とβ3位の水素のみを検出する場合、対象外の水素はすべて重水素に置換した。それらアミノ酸を分子量82kDaのMSG蛋白質に導入してNMR測定を行ったところ、芳香環および脂肪族水素の1次元スペクトルを短時間で非常に高感度に観測することに成功した。また2次元NMR測定を行うことで、芳香環水素と脂肪族水素間のNOE信号も高感度に観測することが出来た。このことから各NMR信号の帰属も可能となった。ロイシンやバリンのメチル水素に関しては、高感度観測が可能となったが、信号同士の縮重が多く、1次元スペクトルのみでは、信号帰属は困難となることが判明した。
これら結果を踏まえ、新型SAILアミノ酸をGroES, GroELおよびGroEs-GroE複合体に導入した。その結果、各試料についてPhe残基δ位及びζ位の水素を高感度に観測することに成功した。従来の13C-1H相関信号は、低温度下では広幅化してしまい、観測が困難であったが、本手法では、低温状態でも高感度な信号を観測することが可能となり、巨大蛋白質複合体を対象として芳香環回転運動の解析も可能となった。
今後は、縦緩和時間を短縮した高感度かつ高速測定技術の開発が必要となる。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2018 Annual Research Report
  • 2017 Annual Research Report
  • Research Products

    (18 results)

All 2018 2017 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (11 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 9 results) Book (1 results) Remarks (2 results)

  • [Int'l Joint Research] Indiana University(米国)

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    • Author(s)
      Kainosho Masatsune、Miyanoiri Yohei、Terauchi Tsutomu、Takeda Mitsuhiro
    • Journal Title

      Journal of Biomolecular NMR

      Volume: 71 Issue: 3 Pages: 119-127

    • DOI

      10.1007/s10858-018-0198-x

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    • Peer Reviewed / Open Access
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    • Author(s)
      Kainosho Masatsune、Miyanoiri Yohei、Takeda Mitsuhiro
    • Journal Title

      Experimental Approaches of NMR Spectroscopy

      Volume: - Pages: 37-61

    • DOI

      10.1007/978-981-10-5966-7_2

    • ISBN
      9789811059650, 9789811059667
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    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 重水素標識技術を利用した高分子量蛋白質の溶液構造解析法の開発2018

    • Author(s)
      宮ノ入洋平
    • Organizer
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      宮ノ入洋平
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      宮ノ入洋平
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  • [Presentation] SAIL-NMR法による高分子量蛋白質の動態解析法の開発2018

    • Author(s)
      宮ノ入洋平
    • Organizer
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      Yohei Miyanoiri
    • Organizer
      Frontiers of Multiscale Structural Biology
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  • [Presentation] Relaxation Optimized SAIL-NMR method for studying structures and dynamics of protein complexes2018

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      Yohei Miyanoiri
    • Organizer
      Frontiers of Multiscale Structural Biology: Order-disorder transitions and dynamic membrane interactions
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    • Author(s)
      Yohei Miyanoiri
    • Organizer
      Symposium on Structure and Folding of Disease related Proteins
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      2017 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Relaxation Optimization using isotope labeling for studying larger proteins by NMR2017

    • Author(s)
      Yohei Miyanoiri
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      The 56th annual meeting of NMR Society of Japan
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  • [Presentation] NMRで観る:高度な安定同位体標識技術を利用した高分子量蛋白質の動態構造解析法2017

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      宮ノ入 洋平
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      宮ノ入 洋平
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  • [Presentation] Relaxation-optimized SAIL NMR for structural studies of large proteins2017

    • Author(s)
      Yohei Miyanoiri
    • Organizer
      2nd Molecular, Cellular, and Life Sciences 2017
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Invited
  • [Book] Experimental Approaches of NMR Spectroscopy; Isotope-Aided Methods for Biological NMR Spectroscopy: Past, Present, and Future2017

    • Author(s)
      Kainosho Masatsune、Miyanoiri Yohei、Takeda Mitsuhiro
    • Total Pages
      636
    • Publisher
      Springer
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  • [Remarks] 大阪大学蛋白質研究所先端計測研究室NMR構造解析グループ

    • URL

      http://www.protein.osaka-u.ac.jp/rcsfp/apc/nmr/

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  • [Remarks] 大阪大学 蛋白質研究所 先端計測研究室

    • URL

      http://www.protein.osaka-u.ac.jp/rcsfp/apc/nmr/

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      2017 Annual Research Report

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Published: 2017-04-28   Modified: 2023-03-20  

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