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Development and application of novel ESR/IR spectroscopic systems for protein dynamics with high time-space resolution

Publicly Offered Research

Project AreaNovel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
Project/Area Number 17H05882
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Complex systems
Research InstitutionKobe University

Principal Investigator

木村 哲就  神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2019-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2018: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2017: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Keywords時間分解分光法 / マイクロ流路デバイス / 顕微赤外分光法 / スピンラベルESR / ダイナミクス観察 / マイクロ流体デバイス / ABCトランスポーター / 量子ビーム / 時間分解測定 / ESR分光法 / 顕微赤外吸収分光法 / フォールディング / タンパク質 / ダイナミクス
Outline of Annual Research Achievements

タンパク質の機能発現機構の解明には『機能発現に伴う分子構造変化』を様々な時空間分解能でとらえることが重要である。 本課題では、スピンラベルESRは微細なコンフォメーション変化を0.1 nm 単位で、赤外分光計測は反応に関連する官能基の局所的な化学構造情報を0.001 nmという高空間分解能で得ることができる。これら二つの分光法を分子拡散を基礎としたマイクロ流路ミキサーとを組み合わせることによって、反応の時間分解計測が可能な、汎用性の高い装置を構築した。装置の組み立てと性能評価を行った上で、タンパク質の立体構造形成、複合体形成に伴う構造変化や、機能部位の電子構造・プロトン化状態、そして化学反応の時間変化の解析を行った。加えて、タンパク質の立体構造形成反応および膜タンパク質の反応への応用を目指し、スピンラベル標識試料の調製法を確立した。
(1) 時間分解SL-ESR測定法の確立: 新たに設計をした分子拡散型ミキサーを用いて、100 μs~数十秒までの広い 時間幅の中で反応を停止させることのできる系を構築した。ESR測定用の試料はSL標識する必要がある。タンパク質立体構造研究のためにはモデルタンパク質として4本のヘリックスから構成されるACBP、および、トランスポーターのダイナミクス研究のために膜タンパク質であり、ヘムを輸送基質とするBhuUV-Tについて、距離測定に適したアミノ酸残基を選び、部位特異的変異導入法によりシステインに変異させ、MTSSLという標識試薬によって部位特異的に標識を行った。
(2) 時間分解IR測定用マイクロ流路ミキサーの作製: 化学エッチング処理を行ったステンレススペーサーを2枚のフッ化カルシウム板で挟むことでマイクロ流路を構築し、SPring-8 BL43IRの赤外放射光を用いた顕微鏡に設置し、鉄の還元反応を追跡し、時間分解計測が可能であることを示した。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2018 Annual Research Report
  • 2017 Annual Research Report
  • Research Products

    (23 results)

All 2019 2018 2017 Other

All Int'l Joint Research (3 results) Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (17 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 6 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] San Jose State University(米国)

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    • Author(s)
      Kimura Tetsunari、Lorenz-Fonfria Victor A.、Douki Shintaro、Motoki Hideyoshi、Ishitani Ryuichiro、Nureki Osamu、Higashi Masahiro、Furutani Yuji
    • Journal Title

      The Journal of Physical Chemistry B

      Volume: 122 Issue: 42 Pages: 9681-9696

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.8b07967

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    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Ultraprecision cutting of single-crystal calcium fluoride for fabricating micro flow cells2018

    • Author(s)
      Ryo KOMIYA, Tetsunari KIMURA, Takashi NOMURA, Minoru KUBO, Jiwang YAN
    • Journal Title

      Journal of Advanced Mechanical Design, Systems, and Manufacturing

      Volume: 12 Issue: 1 Pages: JAMDSM0021-JAMDSM0021

    • DOI

      10.1299/jamdsm.2018jamdsm0021

    • NAID

      130006386864

    • ISSN
      1881-3054
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  • [Presentation] マイクロ流路ミキサーを利用したタンパク質の実時間観察2019

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      木村哲就
    • Organizer
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
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    • Author(s)
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    • Organizer
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
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    • Organizer
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
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  • [Presentation] 部位特異的スピンラベルEPR分光法によるABCトランスポーター; BhuUVの構造変化測定2019

    • Author(s)
      大西萌, 小堀康博, 城宜嗣, 杉本宏, 鍔木基成, 木村哲就
    • Organizer
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
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  • [Presentation] SPring-8における時間分解分光計測系の構築とタンパク質の分子機構解析への応用2019

    • Author(s)
      木村哲就
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      第38回SPring-8先端利用技術ワークショップ~SPring-8放射光実験の生物・材料・無機化学への応用~
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    • Invited
  • [Presentation] タンパク質の化学的ダイナミズム2019

    • Author(s)
      木村哲就
    • Organizer
      第9回K-CONNEX研究会
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    • Invited
  • [Presentation] Real-time measurements of the conformational changes in ABC transporter; BhuUV, revealed by site-directed spin-labeling EPR spectroscopy.2018

    • Author(s)
      大西萌, 鍔木基成, 小堀康博, 木村哲就
    • Organizer
      第56回日本生物物理学会年会
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      藤井宏一, 鍔木基成, 木村哲就
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      第56回日本生物物理学会年会
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  • [Presentation] Vibrational analysis for studying ion-protein interactions of a magnesium ion channel, MgtE.2018

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      木村哲就, Lorenz-Fonfria, Victor, 道喜慎太郎, 根木秀佳, 石谷隆一郎, 濡木理, 東雅大, 古谷祐詞
    • Organizer
      第56回日本生物物理学会年会
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  • [Presentation] Membrane proteins in action; Structural and functional dynamics revealed by time-resolved measurements.2018

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      Tetsunari Kimura
    • Organizer
      International congress on pure and applied chemistry (ICPAC) 2018 Langkawi
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    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 部位特異的スピンラベルEPR分光法によるABCトランスポーター; BhuUVの構造変化の実時間測定2018

    • Author(s)
      大西萌, 鍔木基成, 小堀康博, 木村哲就
    • Organizer
      神戸大学若手フロンティア研究会
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  • [Presentation] 蛍光寿命計測によるアシルCoA結合タンパク質のフォールディング機構の研究2018

    • Author(s)
      藤井宏一, 鍔木基成, 木村哲就
    • Organizer
      神戸大学若手フロンティア研究会
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  • [Presentation] 新規リアルタイム観察装置の開発によるタンパク質の分子機構解明への挑戦2018

    • Author(s)
      木村哲就
    • Organizer
      第6回K-CONNEX研究会
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    • Invited
  • [Presentation] 時間分解可視吸収分光測定によるヘム ABC トランスポーターの輸送メカニズム解析2017

    • Author(s)
      林沙英, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就
    • Organizer
      第17回日本蛋白質科学会年会
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      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] マイクロ流路ミキサーを用いた時間分解分光測定による ABC トランスポーターの分子機構解析2017

    • Author(s)
      木村哲就, 林沙英, 大西萌, 城宜嗣, 杉本宏, 池本夕佳
    • Organizer
      第17回日本蛋白質科学会年会,
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  • [Presentation] ABCトランスポーターの分子機構解明を目指した時間分解測定法の開発2017

    • Author(s)
      木村哲就, 林沙英, 大西萌, 城宜嗣, 杉本宏, 小堀康弘, 池本夕佳
    • Organizer
      第44回生体分子科学討論会
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    • Author(s)
      木村哲就
    • Organizer
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    • Invited
  • [Remarks] 研究室HP

    • URL

      https://tetsukimura-lab.jp

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Published: 2017-04-28   Modified: 2019-12-27  

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