Structural and dynamical studies of multidomain protein
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
17H05888
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Complex systems
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
三島 正規 首都大学東京, 理学研究科, 准教授 (70346310)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2018)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2018: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2017: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | NMR / マルチドメインタンパク質 / vinculin / 常磁性効果 / sortase / SHARP / SAXS / 動的構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マルチドメインタンパク質は、しばしば各ドメインが柔軟なリンカーで繋がった構造でフレキシブルであるため、結晶化が容易でなく、X線結晶構造解析が適用できないことも多い。そこで溶液状態で構造解析が可能なNMRを主に用いて、動的な状態も含めた構造解析を行うことを目的に以下の研究、1と2を進めた。
1. ドメイン間の距離情報を取得するため、常磁性効果を用いたNMR解析が必要である。そこでRNA結合タンパク質Nrd1の安定同位体ラベルしたRRM1-2ドメインと、スピンラベルを導入する部分であるRRM3-4ドメインを連結させた。現在までに高活性型のsortaseを用いた反応で約30%程度の収率で連結した生成物を得ることに成功した。スピンラベルについては、常磁性金属を配位させたDOTA-M8を導入した試料の調製に成功した。
2. さらに1000残基以上の巨大なタンパク質であるvinclulinについて、Nrd1同様に、各ドメインに分割してドメイン選択的にラベルした後、それぞれを連結するアプローチを試みた。これにより、巨大タンパク質でも、より容易に動的構造情報が得る手法の確立を目指した。現在までにvincuinタンパク質をそのＮ端領域である約750残基の部分と、C末端領域の約250残基の重水素化体の調製を行い、それぞれNMR測定に成功した。さらに、これらvinculinの分割された部分どうしを高活性型のsortaseを用いて、低温条件下で連結することに成功し、連結前と連結後ではNMRスペクトルに変化が起こることの確認にも成功した。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(15 results)
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[Journal Article] Structural insights into ubiquitin phosphorylation by PINK12018
Author(s)
Okatsu Kei、Sato Yusuke、Yamano Koji、Matsuda Noriyuki、Negishi Lumi、Takahashi Akiko、Yamagata Atsushi、Goto-Ito Sakurako、Mishima Masaki、Ito Yutaka、Oka Toshihiko、Tanaka Keiji、Fukai Shuya
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 8
Issue: 1
Pages: 10382-10382
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Book] 化学結合論2017
Author(s)
橋本健朗、佐藤総一、西長亨、廣田耕志、三島正規
Total Pages
258
Publisher
放送大学教育振興会
ISBN
9784595317460
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