Structural analysis of bacterial heme transporter

• Project Area: Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
• Project/Area Number: 17H05896
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 杉本 宏 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (90344043)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥13,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000、Indirect Cost: ¥3,000,000); Fiscal Year 2018: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2017: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: ヘム / X線構造解析 / 蛋白質

Outline of Annual Research Achievements

アデノシン三リン酸（ATP）は生体でエネルギーのやりとりを媒介している。病原性バクテリア由来が持つタンパク質であるヘムインポーターも、ATPのエネルギーを駆動力としてヘムをペリプラズムから細胞質への膜輸送を行っている。インポーターのヌクレオチド結合サブユニットへのATP結合や加水分解反応がトランスポーターの膜貫通領域や全体構造の動きとどのように共役しているのかという基本的な現象の作動原理について明らかにすることを目的としている。通常の構造解析によってヘムの非結合型の結晶構造の決定に成功しているが、X線自由レーザーを用いた動的結晶構造を行うための技術基盤開発を行った。また、ヘム結合型の結晶を得ることが困難なことから、溶液状態での解析が可能なクライオ電子顕微鏡法による構造決定を目指してサンプル調製方法の最適化を行った。界面活性剤を用いて二つの膜貫通ドメイン（TMD）と二つのヌクレオチド結合ドメイン（NBD）からなる複合体を可溶化し、Ni-NTAカラム上でPBPとの複合体を形成させた。カラムから溶出させたPBP-TMD-NBD複合体をゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製後の試料の可視吸収スペクトルはSoret帯に吸収極大を示すことから、ヘム結合型であることを確認した。ネガティブ染色した試料を透過型電子顕微鏡による画像撮影によってヘムインポーターと同程度のサイズの粒子が多数観察されたことから安定な状態であることが確認できた。さらに、連携研究者と共同で計算機科学の手法を用いて動的性質を明らかにするために、ヘムインポーターとその周りの生体膜や水分子を模した全原子モデルを再現し、ATP結合の過程をシミュレートした。その結果、大規模な構造変化の過程が明らかとなった。そしてATPの加水分解反応が適切なタイミングで起こるためのタンパク質の制御メカニズムを提案した。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Essex/Diamond Light Source(英国)
• [Journal Article] Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation sensitive metalloproteins (2019)
  • Author(s): Ebrahim, A., Moreno-Chicano, T., Appleby, M. V., Chaplin, A. K., Beale, J. H., Sherrell, D. A., Duyvesteyn, H. M. E., Owada, S., Tono, K., Sugimoto, H., Strange, R. W., Worrall, J. A. R., Axford, D., Owen, R. L., Hough, M. A.
  • Journal Title: IUCrJ Volume: 6 Issue: 4 Pages: 543-543
  • DOI: 10.1107/s2052252519003956
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure and Molecular Mechanism of the Bacterial Heme Transporter (2018)
  • Author(s): 杉本 宏、城 宜嗣
  • Journal Title: Seibutsu Butsuri Volume: 58 Issue: 1 Pages: 022-023
  • DOI: 10.2142/biophys.58.022
  • NAID: 130006322041
  • ISSN: 0582-4052, 1347-4219
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate (2017)
  • Author(s): Tosha Takehiko、Kubo Minoru, et. al
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 8 Issue: 1 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01702-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis for binding and transfer of heme in bacterial heme-acquisition systems (2017)
  • Author(s): Naoe Youichi、Nakamura Nozomi、Rahman Md. Mahfuzur、Tosha Takehiko、Nagatoishi Satoru、Tsumoto Kouhei、Shiro Yoshitsugu、Sugimoto Hiroshi
  • Journal Title: Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics Volume: 85 Issue: 12 Pages: 2217-2230
  • DOI: 10.1002/prot.25386
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ヘム輸送タンパク質の立体構造 (2017)
  • Author(s): 杉本宏
  • Journal Title: 感染・炎症・免疫 Volume: 47 Pages: 41-144
• [Journal Article] Structural Biology of the Bacterial Heme Acquisition and Transport Systems (2017)
  • Author(s): 杉本 宏
  • Journal Title: Nihon Kessho Gakkaishi Volume: 59 Issue: 4 Pages: 166-173
  • DOI: 10.5940/jcrsj.59.166
  • NAID: 130006032057
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Computational Modeling of the Outward-facing Form and the Occluded Intermediate of a Heme Importer with Bound Nucleotides (2018)
  • Author(s): K. Tamura, H. Sugimoto, Y. Shiro, and Y. Sugita
  • Organizer: 256th American Chemical Society National Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 分子シミュレーションによるヘムインポーターの化学-力学共役機構の解明 (2018)
  • Author(s): 田村康一 , 杉本宏 , 城宜嗣 , 杉田有治
  • Organizer: 第56回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Structure analysis of radiation-sensitive NO-bound state of cytochrome P450nor using XFEL at SACLA (2018)
  • Author(s): H. Sugimoto
  • Organizer: 10th International workshop on X-ray radiation damage to biological samples
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural basis of the ABC heme transporter in iron uptake system of pathogenic bacteria (2018)
  • Author(s): H. Sugimoto
  • Organizer: 7th FEBS Special Meeting on ABC Proteins
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 結晶構造から明らかになった病原菌ヘムトランスポーターの分子メカニズム (2017)
  • Author(s): 杉本宏
  • Organizer: 第17回日本蛋白質科学会年会ワークショップ：生体内の金属動態
  • Invited
• [Presentation] 病原菌のヘム輸送タンパク質の立体構造と機能 (2017)
  • Author(s): 杉本宏
  • Organizer: 第41回日本鉄バイオサイエンス学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] Structural basis of the ABC heme transporter in iron uptake system of pathogenic bacteria (2017)
  • Author(s): Hiroshi Sugimoto
  • Organizer: 7th FEBS Special Meeting on ABC Proteins - ABC2018
  • Int'l Joint Research / Invited