膜蛋白質の速くて複雑な動的機能構造を活写するハイブリッド構造解析基盤

• Project Area: Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
• Project/Area Number: 17H05897
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 重松 秀樹 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (00415928)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2018: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2017: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: クライオ電子顕微鏡 / 生物物理 / 動的構造解析 / 構造生物学 / 電子顕微鏡 / 動的構造

Outline of Annual Research Achievements

膜蛋白質として、イオン透過型グルタミン酸受容体の一つであるAMPA受容体について、電子顕微鏡解析用にGSG1LおよびStargazinとの融合蛋白質の作製を行った。界面活性剤可溶化状態での精製後の脂質ナノディスクへの再構成、リポソームへの再構成後に電子顕微鏡による確認を行ったが、現在までのところ良好な結果は得られていない。現段階では、電子顕微鏡での試料の性状確認で良好な結果が得られず、AFMでの解析についてはと計画段階で停滞している。
方法論開発として先行して行っていた電依存性カリウムチャネルKv1.2を脂質小胞に再構成した系では、分解能を向上させるべくより高性能な電子顕微鏡の利用を検討し、米国Yale大学の電子顕微鏡の利用を開始したが、これまでに分解能の向上は得られていない。それまでに使用していたアモルファスカーボン膜によるノイズが問題となり分解能向上が見られないと考え、炭素数層からなるグラフェンを支持膜として用いる系に移行した。理研播磨でのグラフェン作製を試み、電子顕微鏡グリッドへの転写、プラズマ装置による洗浄、生体分子吸着を向上する水素化処理を検討した。転写の効率は高くなったが、まだ、プラズマによる洗浄が十分でない状態である。並行して市販のグラフェン貼り付けグリッドを水素プラズマ処理をし、標準試料での2.5オングストローム構造を得られており、この系をAMPA受容体に適用する。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Yale University(米国)
• [Journal Article] Kinesin-binding-triggered conformation switching of microtubules contributes to polarized transport (2018)
  • Author(s): Shima Tomohiro、Morikawa Manatsu、Kaneshiro Junichi、Kambara Taketoshi、Kamimura Shinji、Yagi Toshiki、Iwamoto Hiroyuki、Uemura Sotaro、Shigematsu Hideki、Shirouzu Mikako、Ichimura Taro、Watanabe Tomonobu M.、Nitta Ryo、Okada Yasushi、Hirokawa Nobutaka
  • Journal Title: The Journal of Cell Biology Volume: 217 Issue: 12 Pages: 4164-4183
  • DOI: 10.1083/jcb.201711178
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural insight into microtubule stabilization and kinesin inhibition by Tau family MAPs (2018)
  • Author(s): Shigematsu Hideki、Imasaki Tsuyoshi、Doki Chihiro、Sumi Takuya、Aoki Mari、Uchikubo-Kamo Tomomi、Sakamoto Ayako、Tokuraku Kiyotaka、Shirouzu Mikako、Nitta Ryo
  • Journal Title: The Journal of Cell Biology Volume: 217 Issue: 12 Pages: 4155-4163
  • DOI: 10.1083/jcb.201711182
  • NAID: 120006599259
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis of epilepsy-related ligand-receptor complex LGI1-ADAM22 (2018)
  • Author(s): Yamagata Atsushi、Miyazaki Yuri、Yokoi Norihiko、Shigematsu Hideki、Sato Yusuke、Goto-Ito Sakurako、Maeda Asami、Goto Teppei、Sanbo Makoto、Hirabayashi Masumi、Shirouzu Mikako、Fukata Yuko、Fukata Masaki、Fukai Shuya
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 9 Issue: 1 Pages: 1546-1546
  • DOI: 10.1038/s41467-018-03947-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dynamic functional assembly of the Torsin AAA+ ATPase and its modulation by LAP1 (2017)
  • Author(s): Chase Anna R.、Laudermilch Ethan、Wang Jimin、Shigematsu Hideki、Yokoyama Takeshi、Schlieker Christian
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 28 Issue: 21 Pages: 2765-2772
  • DOI: 10.1091/mbc.e17-05-0281
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Crystallization and X-ray analysis of 23 nm virus-like particles from Norovirus Chiba strain. (2017)
  • Author(s): Hasegawa K, Someya Y, Shigematsu H, Kimura-Someya T, Nuemket N, Kumasaka T.
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications Volume: 73 Issue: 10 Pages: 568-573
  • DOI: 10.1107/s2053230x17013759
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural basis for CRMP2-induced axonal microtubule formation (2017)
  • Author(s): Niwa Shinsuke、Nakamura Fumio、Tomabechi Yuri、Aoki Mari、Shigematsu Hideki、Matsumoto Takashi、Yamagata Atsushi、Fukai Shuya、Hirokawa Nobutaka、Goshima Yoshio、Shirouzu Mikako、Nitta Ryo
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 7 Issue: 1 Pages: 10681-10681
  • DOI: 10.1038/s41598-017-11031-4
  • NAID: 120006373796
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure of the complete elongation complex of RNA polymerase II with basal factors (2017)
  • Author(s): Ehara Haruhiko、Yokoyama Takeshi、Shigematsu Hideki、Yokoyama Shigeyuki、Shirouzu Mikako、Sekine Shun-ichi
  • Journal Title: Science Volume: 357 Issue: 6354 Pages: 921-924
  • DOI: 10.1126/science.aan8552
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chemical and structural characterization of a model Post-Termination Complex (PoTC) for the ribosome recycling reaction: Evidence for the release of the mRNA by RRF and EF-G (2017)
  • Author(s): Iwakura Nobuhiro、Yokoyama Takeshi、Quaglia Fabio、Mitsuoka Kaoru、Mio Kazuhiro、Shigematsu Hideki、Shirouzu Mikako、Kaji Akira、Kaji Hideko
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 12 Issue: 5 Pages: e0177972-e0177972
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0177972
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Cryo-EM Imaging of Kv1.2 Channels with Membrane Potential Applied (2019)
  • Author(s): Hideki Shigematsu, Youshan Yang, Yangyang Yan, Fred J. Sigworth
  • Organizer: Biophysical Society Annual Meetings
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 高分解能クライオ電子顕微鏡単粒子解析の検討 (2018)
  • Author(s): 重松秀樹
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第74回学術講演会
• [Presentation] クライオ電顕による電位依存性チャネルの作動原理の可視化 (2018)
  • Author(s): Hideki Shigematsu, Youshan Yang, Yanyang Yan, Fred Sigworth
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡解析 (2018)
  • Author(s): 重松秀樹
  • Organizer: AMED BINDSワークショップ「クライオ電顕解析における情報解析技術ワークショップ」
  • Invited
• [Presentation] Functional structure of Kv1.2 ion channel in lipid environment (2017)
  • Author(s): Hideki Shigematsu
  • Organizer: ConBio2017
• [Presentation] Structure of the Kv1.2 Ion Channel in Liposomes (2017)
  • Author(s): Hideki Shigematsu
  • Organizer: Frontiers in Cryo-Electron Microscopy
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡が明らかにする膜蛋白質機能構造 (2017)
  • Author(s): 重松秀樹
  • Organizer: 日本薬学会関東支部大会
  • Invited
• [Presentation] 膜タンパク質の機能構造を明らかにするクライオ電子顕微鏡単粒子解析 (2017)
  • Author(s): 重松秀樹
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第73回学術講演会
• [Remarks] Cryo-electron microscopy shows how stabilizing
  • URL: http://www.riken.jp/en/research/rikenresearch/highlights/20181207_FY20180042/
• [Remarks] 心不全などさまざまな病態を引き起こす微小管結合タンパク質MAP4の構造を高精度に解明
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2018/20181001_1/