ヒト生細胞の分子夾雑環境における核酸の構造と相互作用の解明

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 18H04550
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 片平 正人 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000); Fiscal Year 2019: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2018: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: インセルNMR / 4重鎖 / 分子夾雑 / テロメア / 安定性 / 核酸構造 / 交換速度 / in-cell NMR / 4重鎖構造 / 分子混雑 / 細胞内夾雑 / バイオリアクター / 分子間相互作用 / ヒト生細胞

Outline of Annual Research Achievements

細胞内の込み入った環境下においては、タンパク質や核酸の構造、ダイナミクス及び相互作用は、試験管内の希薄環境下とは異なる事が予想されている。細胞内に導入したタンパク質や核酸のNMRスペクトルを直接観測するin-cell NMR法は、この事を検証する上で有力な手法である。我々は毒素タンパク質SLOによって細胞膜に孔を開けて核酸を導入する手法を高度化する事で、ヒト生細胞中の核酸のin-cell NMRスペクトルを観測する事に世界で初めて成功した。本研究ではこの成果を活用した。in vitroの希薄溶液下では主鎖の向きが3+1型の4重鎖構造を形成するが、in vitroでPEGを加えた擬似的な分子夾雑下ではコンパクトな平行型の4重鎖構造を形成するテロメア配列のDNAに関し、ヒト細胞中におけるイミノプロトンスペクトルを観測・解析した。細胞中のスペクトルは、in vitroにおけるPEG無し及びPEG有りのいずれのスペクトルとも違いがあった。これより細胞中の当該核酸の構造は、希薄溶液下の構造とは異なると共に、PEGによる擬似的な分子夾雑下の構造とも異なる事が強く示唆された。また、核酸とタンパク質(及びその部分ペプチド)の相互作用を生細胞中で検出する事にも取り組んだ。スペクトルの強度が現時点では十分ではなく、細胞に導入する核酸・タンパク質複合体の調製法及び細胞への導入法のさらなる最適化が必要である事が分かった。さらに核酸構造の安定性を、塩基対中のイミノプロトンの水との交換速度を測定・解析する事で、希薄溶液下、PEGを加えた擬似的な分子夾雑下及び実際の生細胞条件下で比較した。その結果、生細胞中の核酸構造の安定性は、PEGを加えた擬似的な分子夾雑環境における安定性とは異なるケースがある事が分かった。以上の結果は、生細胞環境下における情報を直接取得する事の重要性を示している。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Recent progress of in-cell NMR of nucleic acids in living human cells (2020)
  • Author(s): Yamaoki, Y., Nagata, T., Sakamoto, T., and Katahira, M.
  • Journal Title: Biophysical Reviews Volume: - Issue: 2 Pages: 411-417
  • DOI: 10.1007/s12551-020-00664-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development and structural determination of an anti-PrPC aptamer that blocks pathological conformational conversion of prion protein (2020)
  • Author(s): Mashima Tsukasa、Lee Joon-Hwa、Kamatari Yuji O.、Hayashi Tomohiko、Nagata Takashi、Nishikawa Fumiko、Nishikawa Satoshi、Kinoshita Masahiro、Kuwata Kazuo、Katahira Masato
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 4934-4934
  • DOI: 10.1038/s41598-020-61966-4
  • NAID: 120006813315
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] RNA sequence and length contribute to RNA-induced conformational change of TLS/FUS (2020)
  • Author(s): Hamad Nesreen、Mashima Tsukasa、Yamaoki Yudai、Kondo Keiko、Yoneda Ryoma、Oyoshi Takanori、Kurokawa Riki、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 2629-2629
  • DOI: 10.1038/s41598-020-59496-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Analysis of Interactions between Telomeric i-Motif DNA and a Cyclic Tetraoxazole Compound (2018)
  • Author(s): Sedghi Masoud Shadi、Yamaoki Yudai、Ma Yue、Marchand Adrien、Winnerdy Fernaldo Richtia、Gabelica Valerie、Phan Anh Tuan、Katahira Masato、Nagasawa Kazuo
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 19 Issue: 21 Pages: 2268-2272
  • DOI: 10.1002/cbic.201800425
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Unique quadruplex structure and anti-disease activity of RNA aptamer, and in-cell NMR of nucleic acids (2019)
  • Author(s): Katahira, M.
  • Organizer: The 8th Asia-Pacific NMR 2019 Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] In-cell NMR法を用いたヒト生細胞内の核酸の構造と安定性の評価 (2019)
  • Author(s): 山置佑大，永田崇，清石彩華，三宅雅之，Lin Kuan-Heng，高見昇平，加納ふみ，村田昌之，片平正人
  • Organizer: 第21回日本RNA学会年会
• [Presentation] In-cell NMR 法を用いたヒト生細胞内核酸の構造およびダイナミクスの評価 (2019)
  • Author(s): Y. Yamaoki, T. Nagata, A. Kiyoishi, M. Miyake, F. Kano, M. Murata, M. Katahira
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] In-cell NMR法を用いたヒト生細胞内のDNAおよびRNAの構造安定性評価 (2019)
  • Author(s): 山置佑大，永田崇，高見昇平，阪本知樹，片平正人
  • Organizer: 第58回NMR討論会
• [Presentation] In-cell NMR法によるヒト生細胞内における核酸‐リガンド相互作用の解析 (2019)
  • Author(s): 高見昇平，山置佑大，加納ふみ，村田昌之，坂本秦一，原田和雄，永田崇，片平正人
  • Organizer: 第42回分子生物学会
• [Presentation] Protein-quadruplex DNA/RNA interactions in telomere regulation and anti-prion activity, and the first successful observation of in-cell NMR signals in human cells (2018)
  • Author(s): Katahira, M.
  • Organizer: XXVIII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In-cell NMR studies on structure and dynamics of DNA and RNA introduced inside the living human cells (2018)
  • Author(s): Yamaoki, Y.,. Nagata, T., Kiyoishi, A., Miyake, M., . Kuan-Heng, L., Takami, S., Kano, F., Murata, M. and Katahira, M.
  • Organizer: Japan Society of Nucleic Acids Chemistry
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Observation of imino proton signals of DNA and RNA introduced inside the living human cells by using in-cell NMR spectroscopy (2018)
  • Author(s): Yamaoki, Y., Nagata, T., Kiyoishi, A., Miyake, M., Kano, F., Murata, M. and Katahira, M.
  • Organizer: XXVIII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The interaction analysis of a cyclic tetraoxazole with telomeric i-motif DNA (2018)
  • Author(s): Masoud, S. S., Yamaoki, Y., Ma, Y., Marchand, A., Winnerdy, F. R., Gabelica, V., Phan, A. T., Katahira, M. and Nagasawa, K.
  • Organizer: Japan Society of Nucleic Acids Chemistry
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 片平研究室
  • URL: http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/bio/