化学シグナル伝達分子におけるアロステリック機構の動的構造基盤の解析

• Project Area: Frontier research of chemical communications
• Project/Area Number: 18H04626
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 高橋 栄夫 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60265717)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2019: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2018: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: NMR / アロステリック制御 / リガンド結合 / 構造平衡 / 構造変化

Outline of Annual Research Achievements

研究対象としているAMPA型グルタミン酸受容体リガンド結合ドメイン（AMPAR-LBD）およびその変異体を活用したNMR解析により、LBDにおける動的構造平衡のシフトが薬理活性強度を調節する鍵となることを明らかにした研究成果を論文として公表することができた。
さらに、AMPARのアロステリック修飾薬（PAM）が、AMPARの不活性化を抑制するメカニズムを解明する目的で、LBDに対するPAM結合の影響、およびPAMの作用と類似した二量体化促進効果を有する二量体化変異体、についての解析を実施した。等温滴定型カロリメトリーによる相互作用解析を行った結果、二量体化促進に伴い、LBD と アゴニストであるグルタミン酸の相互作用が増強していることが明らかとなった。AMPAR-LBDは溶液中においては単量体で存在する一方、結晶構造としては二量体状態で解かれているものが多いが、二量体を形成してもその構造はほぼ不変であることが知られている。今回の研究から、二量体形成が促進されると静的構造は変化しないものの、リガンド結合能が増大する、すなわち不活性化の抑制を示唆する興味深い結果が得られた。次に、二量体形成に伴う不活性化抑制のメカニズムを理解する目的で、NMR解析を実施した。二量体形成したAMPAR-LBDは分子量5万を超える研究対象であるがMetメチル選択的C13標識体を活用することで、残基レベルの解析が可能となった。NMR解析より、AMPAR-LBDに対するPAMの作用、および二量体化変異体における化学シフト変化には共通したものが見られ、特にリガンド結合部位付近におけるアロステリックな構造変化を示唆する化学シフト変化が観測された。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Cooperative interactions facilitate stimulation of Rad51 by the Swi5-Sfr1 auxiliary factor complex. (2020)
  • Author(s): Argunhan B, Sakakura M, Afshar N, Kurihara M, Ito K, Maki T, Kanamaru S, Murayama Y, Tsubouchi H, Takahashi M, Takahashi H, Iwasaki H.
  • Journal Title: eLife Volume: 9
  • DOI: 10.7554/elife.52566
  • NAID: 120007117502
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural mechanisms underlying activity changes in an AMPA-type glutamate receptor induced by substitutions in its ligand-binding domain (2019)
  • Author(s): Masayoshi Sakakura, Yumi Ohkubo, Hiraku Oshima, Suyong Re, Masahiro Ito, Yuji Sugita, and Hideo Takahashi
  • Journal Title: Structure Volume: 27 Issue: 11 Pages: 1698-1709
  • DOI: 10.1016/j.str.2019.09.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Population shift mechanism for partial agonism of AMPA receptor (2019)
  • Author(s): Oshima H, Re S, Sakakura M, Takahashi H, Sugita Y.
  • Journal Title: Biophys. J. Volume: 116 Issue: 1 Pages: 52-68
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2018.11.3122
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphoinositide binding by the PH domain in ceramide transfer protein (CERT) is inhibited by hyperphosphorylation of an adjacent serine-repeat motif (2018)
  • Author(s): Sugiki Toshihiko、Egawa Daichi、Kumagai Keigo、Kojima Chojiro、Fujiwara Toshimichi、Takeuchi Koh、Shimada Ichio、Hanada Kentaro、Takahashi Hideo
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 293 Issue: 28 Pages: 11206-11217
  • DOI: 10.1074/jbc.ra118.002465
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Methyl-selective isotope labeling using α-ketoisovalerate for the yeast Pichia pastoris recombinant protein expression system (2018)
  • Author(s): Suzuki Rika、Sakakura Masayoshi、Mori Masaki、Fujii Moe、Akashi Satoko、Takahashi Hideo
  • Journal Title: Journal of Biomolecular NMR Volume: 71 Issue: 4 Pages: 213-223
  • DOI: 10.1007/s10858-018-0192-3
  • Peer Reviewed
• [Presentation] NMR相互作用解析による創薬アプローチ (2019)
  • Author(s): 高橋栄夫
  • Organizer: 生有研シンポジウム「生体分子間に働く相互作用解析法の現状と今後の可能性」
  • Invited
• [Presentation] 溶液NMR法を用いた界面活性剤ミセル中における膜タンパク質の比較構造解析 (2019)
  • Author(s): 鈴木里佳、吉田真帆子、廣畑雅史、村田武士、小島慧一、須藤雄気、高橋栄夫
  • Organizer: 第58回NMR討論会
• [Presentation] リコンビナーゼRad51と補助因子Swi5-Sfr1のNMR相互作用解析に向けた基盤研究 (2019)
  • Author(s): 井出優希、坂倉正義、真木孝尚、岩崎博史、高橋栄夫
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Rhomboid proteaseの様々な膜環境変化における酵素活性と熱安定性の評価 (2019)
  • Author(s): 薬袋勇樹、畠山彩由子、平島かれん、坂倉正義、高橋栄夫
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 異なる疑似膜環境中における耐熱性膜タンパク質RxRの構造安定性と機能の解析 (2019)
  • Author(s): 吉田真帆子、鈴木里佳、廣畑雅史、村田武士、小島慧一、須藤雄気、高橋栄夫
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 化学シグナル伝達を制御する動的構造基盤の解析 (2019)
  • Author(s): 高橋栄夫
  • Organizer: 化学コミュニケーションのフロンティア・第5回公開シンポジウム
• [Presentation] Analysis of ligand-induced structural transition of AMPR-LBD in chemical communications (2019)
  • Author(s): Masayoshi Sakakura, Yumi Ohkubo, Seiya Yokoi, Hideo Takahashi
  • Organizer: The 1st International Symposium on Chemical Communication (ISCC2019)
• [Presentation] NMRを用いたAMPA型グルタミン酸受容体リガンド結合ドメインの運動性解析 (2018)
  • Author(s): 大久保優美、坂倉正義、横井誠矢、高橋栄夫
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Rhomboid proteaseの活性メカニズム解明に向けた機能・構造解析 (2018)
  • Author(s): 畠山彩由子、薬袋勇樹、長倉玲音、坂倉正義、高橋栄夫
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 末梢神経ミエリンの膜重層化に関与するタンパク質MPZと脂質との相互作用解析 (2018)
  • Author(s): 森雅樹、坂倉正義、三尾和弘、高橋栄夫
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] NMR analysis of the structural and functional stability of proteins (2018)
  • Author(s): Hideo Takahashi
  • Organizer: The 6th International Symposium on Drug Discovery and Design by NMR
  • Invited
• [Presentation] Methyl-selective 13C incorporation using alpha-ketoisovalerate for the yeast Pichia pastoris expression system (2018)
  • Author(s): Rika Suzuki, Masayoshi Sakakura, Hideo Takahashi
  • Organizer: XXVIII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Int'l Joint Research