蛍光性タンパク質温度センサーを用いた生体内温度分布の意義の解明

• Project Area: Integrative understanding of biological phenomena with temperature as a key theme
• Project/Area Number: 18H04695
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 坂口 怜子 京都大学, 高等研究院, 特定助教 (80723197)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2019: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2018: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
• Keywords: 温度センサー / タンパク質工学 / シグナル伝達 / 熱生産 / 温度生物学 / バイオセンサー / イメージング / 細胞内温度計測 / ライブイメージング

Outline of Annual Research Achievements

内温性動物は、体温を一定に保つために、外気温の変化に応じて体内の熱産生を制御する機構を持っている。哺乳類の熱産生に関しては、特定の細胞内小器官からの熱産生が提唱されているが、これを直接的に評価する方法が不充分であったことから、熱産生の定量的な議論や実際の体温変化への寄与はほとんど理解されていなかった。
現在までに、サルモネラ菌由来の温度感知タンパク質であるTlpAとGFPを融合した、細胞内および細胞内小器官の温度計測を可能とする温度センサータンパク質(tsGFP)を開発した。tsGFPは37℃付近の温度変化を鋭敏に感知し、励起スペクトルの２つの極大の変化をレシオメトリックな変化として検出することができた。tsGFPはタンパク質ベースであることから、遺伝子を導入するだけで非侵襲的に生細胞内・組織内で発現させることができ、さらに細胞内小器官局在シグナル配列を付与することで、各小器官における特異的な観察が可能である。これらのセンサーを用いて、小胞体特異的な熱産生や、ミトコンドリア内の温度分布の可視化に成功している。
本年度は、生体内温度の生理学的な意義の解明のために、モデル生物でのin vivo応用に適した、25℃付近を鋭敏に検出できる改変体と、その変異体で細胞内小器官に特異的に発現するtsGFPをタンパク質工学の手法で作製した。これらの変異体は実際にHeLa細胞内で発現が確認でき、外液温度依存的に蛍光特性の変化が観察できた。このセンサーを使って、ショウジョウバエ由来細胞内での代謝変化に伴うミトコンドリア内温度変化を実証した。また、tsGFPを体内で発現する線虫を作製し、生育温度が異なる環境下で育った線虫の体温の比較を行った。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Technische Universitat Munchen(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] Inserm, Univ Brest(フランス)
• [Journal Article] Variants That Affect Function of Calcium Channel TRPV6 Are Associated With Early-Onset Chronic Pancreatitis. (2020)
  • Author(s): Masamune A, Kotani H, Sorgel FL, Chen JM, Hamada S, Sakaguchi R, Masson E, Nakano E, et al.
  • Journal Title: Gastroenterology Volume: - Issue: 6 Pages: 1626-1641
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2020.01.005
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Fluorescence detection of the nitric oxide-induced structural change at the putative nitric oxide sensing segment of TRPC5. (2020)
  • Author(s): Tajima S, Nakata E, Sakaguchi R, Saimura M, Mori Y, Morii T.
  • Journal Title: Bioorg Med Chem Volume: 28 Pages: 115430-115430
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TRPM7 channels mediate spontaneous Ca2+ fluctuations in growth plate chondrocytes that promote bone development. (2019)
  • Author(s): Qian N, Ichimura A, Takei D, Sakaguchi R, Kitani A, Nagaoka R, Tomizawa M, Miyazaki Y, Miyachi H, Numata T, Kakizawa S, Nishi M, Mori Y, Takeshima H.
  • Journal Title: Science signaling Volume: 12 Issue: 576 Pages: 4847-4847
  • DOI: 10.1126/scisignal.aaw4847
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Contribution of Coiled-Coil Assembly to Ca2+/Calmodulin-Dependent Inactivation of TRPC6 Channel and its Impacts on FSGS-Associated Phenotypes (2019)
  • Author(s): Polat Onur K.、Uno Masatoshi、Maruyama Terukazu、Tran Ha Nam、Imamura Kayo、Wong Chee Fah、Sakaguchi Reiko、Ariyoshi Mariko、Itsuki Kyohei、Ichikawa Jun、Morii Takashi、Shirakawa Masahiro、Inoue Ryuji、Asanuma Katsuhiko、Reiser Jochen、Tochio Hidehito、Mori Yasuo、Mori Masayuki X.
  • Journal Title: Journal of the American Society of Nephrology Volume: 30 Issue: 9 Pages: 1587-1603
  • DOI: 10.1681/asn.2018070756
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Intracellular thermometry with fluorescent sensors for thermal biology (2018)
  • Author(s): Okabe Kohki、Sakaguchi Reiko、Shi Beini、Kiyonaka Shigeki
  • Journal Title: Pflugers Arch. Volume: - Issue: 5 Pages: 717-731
  • DOI: 10.1007/s00424-018-2113-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of fluorescent tools to visualize intracellular signaling. (2019)
  • Author(s): Reiko Sakaguchi
  • Organizer: International Symposium of Biofunctional Chemistry
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 蛍光性タンパク質温度センサーを用いた生体内温度分布の可視化とその意義の解明 (2019)
  • Author(s): 坂口 怜子, 森 泰生
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会
  • Invited
• [Presentation] 生体内シグナルの可視化と制御 (2019)
  • Author(s): 坂口 怜子
  • Organizer: 新学術領域「酸素生物学」シンポジウム「分子から個体へ：俯瞰と接近の生命科学」
• [Presentation] ミトコンドリアのエネルギー産生システムの 理解を目指した細胞内温度センサーの開発 (2019)
  • Author(s): 坂口怜子、清中茂樹、森井孝、森泰生
  • Organizer: 京都大学エネルギー理工学研究所 ゼロエミッションエネルギー研究拠点 平成３０年度 共同利用・共同研究成果報告会
  • Invited
• [Presentation] 二光子励起燐光寿命イメージングによる腫瘍深部酸素濃度の非侵襲的な定量観察 (2018)
  • Author(s): 坂口怜子、吉原利忠、飛田成史、森泰生
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Development of Intracellular Thermosensors for the Understanding of Energy Production in Mitochondria (2018)
  • Author(s): Reiko Sakaguchi
  • Organizer: The 9th International Symposium of Advanced Energy Science
  • Int'l Joint Research / Invited