蛍光スイッチ分子の化学デザインと生体イメージング

• Project Area: Resonance Biology for Innovative Bioimaging
• Project/Area Number: 18H04735
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 堀 雄一郎 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00444563)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000); Fiscal Year 2019: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2018: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
• Keywords: フォトクロミック分子 / RESOLFT / 蛍光スイッチング分子 / 超解像イメージング / PYPタグ / OFF-ON-OFF型蛍光プローブ / タンパク質分解 / 蛍光スイッチ分子

Outline of Annual Research Achievements

超解像イメージング技術の一つであるRESOLFTは、光照射により蛍光強度を変化させる蛍光スイッチ分子を用いて分解能を向上させる手法である。これまで、蛍光スイッチ機能を持つ蛍光タンパク質や合成プローブが開発されてきたが、光安定性が低いことや添加剤が必要であるなどの問題が指摘されていた。そこで本研究では、光安定性の高い蛍光色素を用いた、還元剤を必要とせずに蛍光強度制御が可能な蛍光スイッチング分子の設計・合成・開発を行った。
蛍光スイッチング分子を開発するうえで、アリルアゾピラゾール（AAP）というフォトクロミック分子に着目した。AAPは、光照射により、E-Z異性化を引き起こす。AAPの重要な点は、異性化反応が、異なる波長の光照射によってのみ起こり、熱異性化は起こらないということである。そこで、AAPを光照射により構造制御可能なリンカーとして用い、その両端に蛍光色素と消光基を繋いだ分子を設計した。この分子では、AAPがZ体であるときのみ蛍光色素は消光基と会合し消光し、E体に構造変化すると蛍光色素と消光基が空間的に離れるため、会合消光が解消される。蛍光色素としては光安定性の高いTAMRAを、消光基としては、TAMRAの蛍光を会合消光できることの分かっているジニトロベンゼン（DNB）を選択した。
分子力学計算を利用し、AAPと色素もしくはDNBの間の最適なリンカー構造を決定し、三つのプローブを開発した。そのうちの一つのSC1は光照射により、蛍光強度が50%低下した。更に、365 nmと530 nmの光を交互に繰り返し照射したところ、蛍光強度の可逆的な増減が観測された。光照射回数によらず、観測される蛍光強度に変化はなかった。以上の結果から、光安定性が高く添加物なしで蛍光強度を制御できる蛍光スイッチング分子の開発に成功した。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Development of Fluorogenic Probes for Rapid High-Contrast Imaging of Transient Nuclear Localization of Sirtuin 3 (2020)
  • Author(s): Gao J, Hori Y, Shimomura T, Bordy M, Hasserodt J, Kikuchi K
  • Journal Title: Chembiochem Volume: 21 Issue: 5 Pages: 656-662
  • DOI: 10.1002/cbic.201900568
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Live-Cell Imaging of Protein Degradation Utilizing Designed Protein-Tag Mutant and Fluorescent Probe with Turn-Off Switch (2020)
  • Author(s): Gao J, Hori Y, Takeuchi O, Kikuchi K
  • Journal Title: Bioconjug Chem Volume: 31 Issue: 3 Pages: 577-583
  • DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.9b00696
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Engineered Protein-tag for Rapid Live-cell Fluorogenic Visualization of Proteins by Anionic Probes (2020)
  • Author(s): Gao J, Hori Y, Nishiura M, Bordy M, Hasserodt J, Kikuchi K
  • Journal Title: Chem Lett Volume: 49 Issue: 3 Pages: 232-235
  • DOI: 10.1246/cl.190875
  • NAID: 130007805930
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Rapid no-wash labeling of PYP-tag proteins with reactive fluorogenic ligands affords stable fluorescent protein conjugates for long-term cell imaging studies (2020)
  • Author(s): Kumar N, Hori, Y. Nishiura M, Kikuchi K
  • Journal Title: Chem Sci Volume: 11 Issue: 14 Pages: 3694-3701
  • DOI: 10.1039/d0sc00499e
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of photoswitchable fluorescent molecules using arylazopyrazole (2020)
  • Author(s): Torii K, Hori Y, Watabe K, Kikuchi K
  • Journal Title: Bull Chem Soc Jpn. Volume: - Issue: 7 Pages: 821-824
  • DOI: 10.1246/bcsj.20200077
  • NAID: 130007879560
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of an effective protein-labeling system based on smart fluorogenic probes (2019)
  • Author(s): Reja SI, Minoshima M, Hori Y, Kikuchi K
  • Journal Title: J Biol Inorg Chem Volume: 24 Issue: 4 Pages: 443-455
  • DOI: 10.1007/s00775-019-01669-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Photoactive yellow protein and its chemical probes: an approach to protein labelling in living cells (2019)
  • Author(s): Kumar N, Hori Y, Kikuchi K
  • Journal Title: J Biochem Volume: 166 Issue: 2 Pages: 121-127
  • DOI: 10.1093/jb/mvz051
  • NAID: 40021974863
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chemical Tools with Fluorescence Switches for Verifying Epigenetic Modifications (2019)
  • Author(s): Hori Y, Kikuchi K
  • Journal Title: Acc Chem Res Volume: 52 Issue: 10 Pages: 2849-2857
  • DOI: 10.1021/acs.accounts.9b00349
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Live‐Cell Imaging of DNA Methylation Based on Synthetic‐Molecule/Protein Hybrid Probe (2018)
  • Author(s): Kumar Naresh、Hori Yuichiro、Kikuchi Kazuya
  • Journal Title: The Chemical Record Volume: 18 Issue: 12 Pages: 1672-1680
  • DOI: 10.1002/tcr.201800039
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 蛍光スイッチ機能を持つ エピジェネティクス可視化ツールの開発 (2018)
  • Author(s): 堀 雄一郎
  • Organizer: 第91回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] Development of Fluorogen/Protein Hybrid Probes for Imaging Endogenous Biomolecules (2018)
  • Author(s): Yuichiro Hori
  • Organizer: Institute for Protein Research International Seminar “Frontiers in Peptide Science 2018”
  • Invited