蛍光リガンド・受容体一体型センサーによる細胞間コミュニケーションの解析

• Project Area: Resonance Biology for Innovative Bioimaging
• Project/Area Number: 18H04741
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70217149)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000); Fiscal Year 2019: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2018: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
• Keywords: 蛍光センサー / FRET / 蛍光タンパク質 / 受容体 / リガンド / シリカ不織布 / アセチルコリン / アンジオテンシンII / 細胞外メッセンジャー / イメージング / TGFβ / FGF

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、蛍光ラベルした受容体と蛍光リガンドの結合によって起こるFRETが、サンプル中のリガンドによって低下する事を利用する新しい測定法（競合FRET法）を使って、細胞外メッセンジャー測定センサーを開発する。さらにそれを発展させ、分子内にリガンド部とその結合サイトをもつtethered型センサー技術の確立を試みた。これらの方法を使って唾液腺におけるCa2+オシレーションの組織レベル同調のしくみや、歯原性上皮細胞(SF2細胞)と歯髄幹細胞（DPSC）の共培養によって発生する自発的Ca2+オシレーションのしくみを明らかにする。
競合FRET法を新しいセンサー開発に利用できる事を確認するために、蛍光ラベルしたアビジンと蛍光ビオチンの結合や、蛍光ラベルした抗体と蛍光抗原の結合によって起こるFRETが、競合分子によって減弱することを確認した。またCFPを連結したIP3受容体のリガンド結合部（CFP-LBD）への蛍光リガンドの結合によって、従来の１分子型センサー（LIBRA）の約10倍の蛍光変化率が起こることに加えて、FRETドナーとしてCFPを円順列変異体やチオール反応性蛍光物質を使用することで、蛍光変化率をさらに大きく改善できることが明らかになった。
これらの技術をtethered型センサーの開発に応用するために、ビオチン・アデノホスチン誘導体(B-ADA)を合成し蛍光アビジンを使ったIP3の測定に成功した。そこでCFP-LBDにアビジン・コンカタマーを連結させたリガンド・受容体一体型IP3センサーを作成してB-ADAによる蛍光変化を確認した。しかし蛍光変化率が期待の20%程度であったため、AngIIやEGFセンサーへの応用は難しいと判断し、SpyCatcher/SpyTag（SpyC/SpyT）技術を利用して2つの分子を結合させた改良型tethered型IP3センサーを作成した。この結果からSpyC/SpyT技術がtethered型センサーの作成に利用可能であるが、さらなる蛍光変化率の改善が必要と考えられた。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Auckland(ニュージーランド)
• [Int'l Joint Research] KU Leuven(ベルギー)
• [Journal Article] Association Between N-Desmethylclozapine and Clozapine-Induced Sialorrhea: Involvement of Increased Nocturnal Salivary Secretion via Muscarinic Receptors by N-Desmethylclozapine (2020)
  • Author(s): Ishikawa Shuhei、Kobayashi Masaki、Hashimoto Naoki、Mikami Hideaki、Tanimura Akihiko、Narumi Katsuya、Furugen Ayako、Kusumi Ichiro、Iseki Ken
  • Journal Title: Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics Volume: 375 Issue: 2 Pages: 376-384
  • DOI: 10.1124/jpet.120.000164
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Competitive Fluorescent Ligand Assay for Inositol 1,4,5-Trisphosphate (2019)
  • Author(s): Tanimura Akihiko、Shuto Satoshi
  • Journal Title: Methods in molecular biology Volume: 2091 Pages: 137-144
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-0167-9_12
  • ISBN: 9781071601662, 9781071601679
• [Journal Article] 新規組織透明化技術による歯および歯周組織の立体構造解析 (2019)
  • Author(s): 石田 成美, 関 有里, 根津 顕弘, 谷村 明彦
  • Journal Title: 北海道医療大学歯学会雑誌 Volume: 38 Pages: 29-36
  • NAID: 120006821070
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 歯原性上皮細胞におけるマイグレーションの制御因子の同定-成長因子とケモカインの相互作用－ (2019)
  • Author(s): 村田 佳織，石田 成美，齊藤 正人，谷村 明彦
  • Journal Title: 北海道医療大学歯学会雑誌 Volume: 38 Pages: 1-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of full-length human amelogenin on the differentiation of dental epithelial cells and osteoblastic cells (2019)
  • Author(s): Takahashi Ayumi、Morita Takao、Murata Kaori、Minowa Erika、Jahan Azmeree、Saito Masato、Tanimura Akihiko
  • Journal Title: Archives of Oral Biology Volume: 107 Pages: 104479-104479
  • DOI: 10.1016/j.archoralbio.2019.07.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Simultaneous monitoring of Ca2+ responses and salivary secretion in live animals reveals a threshold intracellular Ca²⁺ concentration for salivation. (2019)
  • Author(s): Nezu A, Morita T, Nagai T, Tanimura A
  • Journal Title: Experimental physiology Volume: 104 Issue: 1 Pages: 61-69
  • DOI: 10.1113/ep086868
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Bcl-2 and IP3 compete for the ligand-binding domain of IP3Rs modulating Ca2+ signaling output (2019)
  • Author(s): Ivanova Hristina、Wagner Larry E.、Tanimura Akihiko、Vandermarliere Elien、Luyten Tomas、Welkenhuyzen Kirsten、Alzayady Kamil J.、Wang Liwei、Hamada Kozo、Mikoshiba Katsuhiko、De Smedt Humbert、Martens Lennart、Yule David I.、Parys Jan B.、Bultynck Geert
  • Journal Title: Cellular and Molecular Life Sciences Volume: 0 Issue: 19 Pages: 0-0
  • DOI: 10.1007/s00018-019-03091-8
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 生体内の分子・機能を観るバイオイメージング技術 (2019)
  • Author(s): 谷村 明彦
  • Journal Title: O Plus E Volume: in press
• [Journal Article] 歯原性上皮細胞におけるマイグレーションの制御因子の同定―成長因子とケモカインの相互作用－ (2019)
  • Author(s): 村田佳織，石田成美，齊藤 正人，谷村 明彦
  • Journal Title: 北海道医療大学歯学雑誌 Volume: in press
• [Journal Article] Measurement of IP3 by using Competitive Fluorescent Ligand Assay (CFLA) method (2019)
  • Author(s): Jahan A, Nezu A, Tanimura A
  • Journal Title: 北海道医療大学歯学雑誌 Volume: in press
• [Journal Article] Bcl 2 and IP3 compete for the ligand_binding domain of IP3Rs modulating Ca2+ signaling output (2019)
  • Author(s): Ivanova H, Wagner LE II, Tanimura A, Vandermarliere E, Luyten T, Welkenhuyzen K, De Smedt H, Lennart ML,Yule DI,Parys JB, Bultynck G
  • Journal Title: Cellular and Molecular Life Sciences Volume: in press
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] InVivo imaging study for the regulation of salivary gland functions. (2018)
  • Author(s): Tanimura A
  • Journal Title: Impact Volume: 2018
  • Open Access
• [Journal Article] Advances in methods for analyzing IP₃ signaling and understanding of coupled Ca²⁺ and IP₃ oscillations (2018)
  • Author(s): 谷村明彦，根津顕弘，森田貴雄，村田佳織
  • Journal Title: Folia Pharmacologica Japonica Volume: 152 Issue: 1 Pages: 21-27
  • DOI: 10.1254/fpj.152.21
  • NAID: 130007403956
  • ISSN: 0015-5691, 1347-8397
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 薬物性歯肉増殖症におけるTGF‐βの関与 (2018)
  • Author(s): 蓑輪映里佳, 谷村明彦, 齊藤正人
  • Journal Title: 北海道医療大学歯学雑誌 Volume: 37 Pages: 55-55
  • NAID: 120006495190
• [Presentation] 歯原性上皮細胞株と歯髄幹細胞の共培養による自発的Ca2+応答の解析 (2020)
  • Author(s): 石田成美, 谷村明彦
  • Organizer: 日本歯科保存学会2020年度秋季学術大会（第１５３回）
• [Presentation] Intravital imagingと遺伝子解析による唾液腺における代償性機能亢進の分子機構の解明 (2020)
  • Author(s): 根津顕弘，高橋 茂，森田貴雄，谷村明彦
  • Organizer: 第62回歯科基礎医学会学位術大会
• [Presentation] ラットグリア細胞腫瘍由来C6細胞のATP刺激による細胞体と突起部のカルシウム応答の特性 (2020)
  • Author(s): 郷賢治，根津顕弘，照光真，谷村明彦
  • Organizer: 第62回歯科基礎医学会学位術大会
• [Presentation] 原性上皮細胞株と歯髄幹細胞の共培養による自発的Ca2+振動の増強 (2020)
  • Author(s): 石田成美, 村田佳織, 谷村明彦
  • Organizer: 第62回歯科基礎医学会学位術大会
• [Presentation] Analysis of acetylcholine-induced salivary secretion in different AQP5 expression rat strains (2020)
  • Author(s): Tahmina Akter, Akihiro Nezu, Akihiko Tanimura
  • Organizer: 第62回歯科基礎医学会学位術大会
• [Presentation] Development of fluorescent biosensors using competitive FRET analyses (2020)
  • Author(s): Azmeree Jahan, Akihiro Nezu, Akihiko Tanimura
  • Organizer: 第62回歯科基礎医学会学位術大会
• [Presentation] 蛍光イメージングによるCa2+シグナル解析とその応用－細胞レベルから個体レベル－ (2020)
  • Author(s): 谷村明彦，根津顕弘
  • Organizer: 第62回歯科基礎医学会学位術大会（アップデートシンポジウム：細胞内Ca2+による細胞機能の調節：パッチクランプ法から光学イメージング法によるアプローチまで）
  • Invited
• [Presentation] グリア細胞腫瘍に由来するC6細胞のATPによる局所的カルシウムイオン濃度の上昇とその発生機構 (2020)
  • Author(s): 郷 賢治, 根津 顕弘, 照光 真, 谷村 明彦
  • Organizer: 北海道医療大学歯学会第38回学術大会
• [Presentation] In vivo機能解析と遺伝子情報に基づく唾液腺機能亢進機構の研究と口腔乾燥症治療への提案 (2019)
  • Author(s): 谷村明彦，根津顕弘，森田貴雄
  • Organizer: 第61回歯科基礎医学会学術大会
  • Invited
• [Presentation] 知症の発症・進行と関連しうる細胞内カルシウム動態とその変調に関する最近の知見 (2019)
  • Author(s): 谷村明彦
  • Organizer: 認知症と口腔機能研究会 第１回学術集会
  • Invited
• [Presentation] 歯原性上皮細胞株と歯髄幹細胞の共培養によるCa2+応答のイメージング解析 (2019)
  • Author(s): 石田成美, 村田佳織, 谷村明彦
  • Organizer: 第61回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] ATPによるC6グリア由来細胞の局所的カルシウムイオン濃度の上昇とその発生機構 (2019)
  • Author(s): 郷 賢治，根津顕弘，照光真, 谷村明彦
  • Organizer: 第61回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] ヒト歯肉線維芽細胞における生理的刺激によるCa2+応答とフェニトインの作用 (2019)
  • Author(s): 蓑輪 映里佳, 根津顕弘, 倉重 圭史, 齊藤 正人, 谷村 明彦
  • Organizer: 第61回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] Analysis of acetylcholine-induced tissue-widely synchronized Ca2+ oscillations in rat submandibular gland using intravital imaging (2019)
  • Author(s): Akihiro Nezu, Takao Morita, Akihiko Tanimura
  • Organizer: Resonance Bio International Symposium (RBIS)
• [Presentation] 超短時間組織透明化法とがんの診断および治療薬開発への応用 (2019)
  • Author(s): 金久保千晶,横山真子,吉田光希,佐藤惇,安彦善裕,谷村明彦
  • Organizer: 第61回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] アセチルコリンによって生じる顎下腺の組織レベルで同調するCa2+オシレーションとその発生機構 (2019)
  • Author(s): 根津顕弘，森田貴雄，石井久淑，谷村明彦
  • Organizer: 第61回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] Development of a novel fluorescent assay system with non-woven fabric of carboxylic acid-modified silica (2019)
  • Author(s): Azmeree Jahan, Narumi Ishida, Akihiko Tanimura
  • Organizer: 第61回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] アセチルコリンによって生じる顎下腺の組織レベルで同調するCa2+オシレーションと血流動態 (2019)
  • Author(s): 根津顕弘，森田貴雄，永井健治，石井久淑，谷村明彦
  • Organizer: 第70回日本薬理学会北部会
• [Presentation] 歯原性上皮細胞株と歯髄幹細胞の共培養によるCa2+応答の発生機構 (2019)
  • Author(s): 石田成美,村田佳織,谷村明彦
  • Organizer: 第33回北海道薬物作用談話会
• [Presentation] Development of a novel fluorescent assay system with non-woven fabric of carboxylic acid-modified silica (2019)
  • Author(s): Azmeree Jahan, Narumi Ishida, Akihiko Tanimura
  • Organizer: 第33回北海道薬物作用談話会
• [Presentation] ATPによるグリア細胞のカルシウムイオン濃度の上昇とその機構 (2019)
  • Author(s): 郷賢治，根津顕弘，照光真,谷村明彦
  • Organizer: 第33回北海道薬物作用談話会
• [Presentation] ヒト歯肉線維芽細胞のCa2+排出機構に対するフェニトインの作用 (2019)
  • Author(s): 蓑輪映里佳，ソヨッドトウフィクルイスラム，倉重圭史，村田佳織，谷村明彦，齊藤正人
  • Organizer: 第57回日本小児歯科学会大会
• [Presentation] Development of improved IP3 biosensors using circularly permuted fluorescent proteins (2019)
  • Author(s): Azmeree Jahan, Kaori Murata, Takao Morita, Akihiro Nezu, Akihiko Tanimura
  • Organizer: 北海道医療大学歯学会第37回学術大会
• [Presentation] ヒト歯肉線維芽細胞におけるCa2+動態の変化とフェニトインの作用 (2019)
  • Author(s): 蓑輪映里佳，倉重圭史，村田佳織，根津顕弘，谷村明彦，齊藤正人
  • Organizer: 北海道医療大学歯学会第37回学術大会
• [Presentation] ヒト歯肉線維芽細胞におけるCa2+動態の変化とフェニトインの作用． (2019)
  • Author(s): 蓑輪映里佳，倉重圭史，村田佳織，根津顕弘，谷村明彦，齊藤正人．
  • Organizer: 北海道医療大学歯学会第37回学術大会
• [Presentation] Development of improved IP3 biosensors using circularly permuted fluorescent proteins (2019)
  • Author(s): Azmeree Jahan, 村田佳織, 森田貴雄, 根津顕弘, 谷村明彦
  • Organizer: 北海道医療大学歯学会第37回学術大会
• [Presentation] In vivo Ca2+イメージングと遺伝子発現の網羅的解析による唾液腺の代償性機能亢進機序の解明 (2018)
  • Author(s): 根津顕弘，森田貴雄，永井健治，谷村明彦
  • Organizer: 第63回日本唾液腺学会学術集会
• [Presentation] In vivo Ca2+イメージングと遺伝子の網羅的解析による唾液腺代償性機能亢進の分子メカニズムの解析 (2018)
  • Author(s): 根津顕弘，森田貴雄，谷村明彦.
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] ヒト歯肉線維芽細胞におけるCa2+動態とフェニトインの作用 (2018)
  • Author(s): 蓑輪映里佳, 村田佳織, 倉重佳史, 齊藤正人, 谷村明彦
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] 唾液腺培養細胞におけるムスカリン受容体刺激による遺伝子発現変化 (2018)
  • Author(s): 森田貴雄, 根津顕弘, 梨田智子, 谷村明彦
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] In vivo Ca2+イメージングと遺伝子の網羅的解析による唾液腺代償性機能亢進の分子メカニズムの解析 (2018)
  • Author(s): 根津顕弘, 森田貴雄, 谷村明彦
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] 歯原生上皮細胞のマイグレーションと遺伝子発現におけるカルシウム応答の役割 (2018)
  • Author(s): 村田佳織, 森田貴雄, 根津顕弘, 齊藤正人, 谷村明彦
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] Role of the store-operated calcium entry on differentiation of dental epithelial cells． (2018)
  • Author(s): Kaori Murata, Takao Morita, Akihiro Nezu, Masato Saitoh, Akihiko Tanimura.
  • Organizer: WCP2018 KYOTO 18th world congress of basic and clinical pharmacology_
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Simultaneous monitoring of Ca2+ response and salivary secretion in rat submandibular gland in live animals. (2018)
  • Author(s): Akihiro Nezu, Takao Morita, Akihiko Tanimura.
  • Organizer: WCP2018 KYOTO 18th world congress of basic and clinical pharmacology_
  • Int'l Joint Research
• [Patent(Industrial Property Rights)] FRET法における被験物質蛍光センサーの固定用無機系繊維シート (2018)
  • Inventor(s): 谷村明彦 小島理恵 佐々木晧平 川部雅章
  • Industrial Property Rights Holder: 谷村明彦 小島理恵 佐々木晧平 川部雅章
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2018-179893
  • Filing Date: 2018