Production of phytohormones by using massive protein expression system in plants

• Project Area: Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries
• Project/Area Number: 19H04637
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 三浦 謙治 筑波大学, 生命環境系, 教授 (00507949)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2020: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2019: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: 植物におけるタンパク質大量発現システム / つくばシステム / 植物ホルモン / ストリゴラクトン / 壊死抑制 / ブラシノステロイド / 壊疽抑制

Outline of Research at the Start

申請者は植物における世界最強のタンパク質大量発現システム「つくばシステム」（4 mg/g植物体 のタンパク質発現量）の開発に成功している。そこで、本システムにより生合成酵素を大量発現させることで、植物ホルモンであるストリゴラクトンおよびブラシノステロイドを大量生産させることを目的とする。本方法により、植物二次代謝産物の生産が可能となれば、植物を活用した物質生産プラットフォームの確立につながる。

Outline of Annual Research Achievements

植物においてタンパク質を大量に発現させる際に問題となるのが、タンパク質によっては壊死が引き起こされることであり、壊死により生合成酵素が分解され、代謝産物の蓄積量も低下してしまう。我々は200 mMアスコルビン酸を噴霧することで、壊死を抑制することができた。
植物ホルモンであるストリゴラクトンを蓄積させるにあたり、βカロテンを出発物質として、D27, CCD7, CCD8, CYP711A2およびP450還元酵素を、つくばシステムにより植物にて高発現させた。最終産物である4-デオキシオロバンコール（4DO、ストリゴラクトンの１つ）の蓄積量をアスコルビン酸噴霧の有無で調べると、アスコルビン酸噴霧により、約1000倍の蓄積量の上昇が見られた。これまで、イネd14変異体におけるストリゴラクトンの蓄積量が最大であったが、今回の蓄積量ははるかに上回り、植物におけるストリゴラクトンの蓄積量としては世界最高レベルであった。また、ストリゴラクトンとしての機能を示すかを調べるため、アーバスキュラー菌根菌（AM菌）が誘引されるかを調べたところ、4DOを与えた場合、AM菌が多く誘引されることが明らかとなった。これらの結果から、つくばシステムを用いて、機能性ストリゴラクトンを大量に植物体内に蓄積させることに成功した。
植物ホルモンであるブラシノステロイドを蓄積するにあたり、カンペステロールを出発物質として、CYP90A1、CYP90B1、DET2、CYP90C1、CYP85A2およびP450還元酵素を高発現させ、アスコルビン酸噴霧を行った。ブラシノステロイドの１種であるカスタステロンの蓄積量としては世界最高レベルであった。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Michigan State University(米国)
• [Journal Article] Prevention of necrosis caused by transient expression in Nicotiana benthamiana by application of ascorbic acid (2021)
  • Author(s): Nosaki Shohei、Kaneko Mika K、Tsuruta Fuminori、Yoshida Hideki、Kato Yukinari、Miura Kenji
  • Journal Title: Plant Physiology Volume: online published Issue: 2 Pages: 832-835
  • DOI: 10.1093/plphys/kiab102
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Radish sprouts as an efficient and rapidly available host for an agroinfiltration-based transient gene expression system (2020)
  • Author(s): Kitajima Sakihito、Miura Kenji、Yasuda Junko
  • Journal Title: Plant Biotechnology Volume: 37 Issue: 1 Pages: 89-92
  • DOI: 10.5511/plantbiotechnology.19.1216a
  • NAID: 130007822565
  • ISSN: 1342-4580, 1347-6114
  • Year and Date: 2020-03-25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] RAP Tag and PMab-2 Antibody: A Tagging System for Detecting and Purifying Proteins in Plant Cells (2020)
  • Author(s): Miura Kenji、Yoshida Hideki、Nosaki Shohei、Kaneko Mika K.、Kato Yukinari
  • Journal Title: Frontiers in Plant Science Volume: 11 Pages: 510444-510444
  • DOI: 10.3389/fpls.2020.510444
  • NAID: 120007166911
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 植物における一過的タンパク質発現システム ～「つくばシステム」の開発と応用展開 (2020)
  • Author(s): 三浦謙治
  • Journal Title: グリーンテクノロジー Volume: 11 Pages: 33-35
• [Journal Article] The PHD finger of Arabidopsis SIZ1 recognizes trimethylated histone H3K4 mediating SIZ1 function and abiotic stress response (2020)
  • Author(s): Miura Kenji、Renhu Na、Suzaki Takuya
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 3 Issue: 1 Pages: 23-23
  • DOI: 10.1038/s42003-019-0746-2
  • NAID: 120007127684
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Autoregulation of nodulation pathway is dispensable for nitrate-induced control of rhizobial infection (2020)
  • Author(s): Nishida, H., Ito, M., Miura K., Kawaguchi, M. and Suzaki, T.
  • Journal Title: Plant Signaling & Behavior Volume: 15 Issue: 3 Pages: 1733814-1733814
  • DOI: 10.1080/15592324.2020.1733814
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Agroinfiltration-based efficient transient protein expression in leguminous plants (2019)
  • Author(s): Suzaki T., Tsuda M., Ezura H., Day B., and Miura K.
  • Journal Title: Plant Biotechnology Volume: 36 Issue: 2 Pages: 119-123
  • DOI: 10.5511/plantbiotechnology.19.0220b
  • NAID: 130007672672
  • ISSN: 1342-4580, 1347-6114
  • Year and Date: 2019-06-25
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Presence of a basic secretory protein in xylem sap and shoots of poplar in winter and its physicochemical activities against winter environmental conditions (2019)
  • Author(s): T. Aohara, J. Furukawa, K. Miura, S. Tsuda, J. S. Poisson, R. N. Ben, P. W. Wilson, S. Satoh
  • Journal Title: J. Plant Research Volume: 132 Issue: 5 Pages: 655-665
  • DOI: 10.1007/s10265-019-01123-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Efficient transient protein expression in plants, ‘Tsukuba system’ (2019)
  • Author(s): 三浦 謙治
  • Journal Title: Regulation of Plant Growth & Development Volume: 54 Issue: 1 Pages: 77-81
  • DOI: 10.18978/jscrp.54.1_77
  • NAID: 130007668430
  • ISSN: 1346-5406, 2189-6305
• [Journal Article] Role of Ca²⁺-Permeable Channels MCA1 and MCA2 in Response to Cold Stress (2019)
  • Author(s): 三浦 謙治、飯田 秀利
  • Journal Title: Cryobiology and Cryotechnology Volume: 65 Issue: 2 Pages: 45-50
  • DOI: 10.20585/cryobolcryotechnol.65.2_45
  • NAID: 130007782651
  • ISSN: 1340-7902, 2424-1555
• [Presentation] RAPタグとタグ抗体PMab-2 抗体：植物細胞における検出、精製のためのタグシステム (2021)
  • Author(s): 三浦謙治、野崎翔平、金子美華、加藤幸成
  • Organizer: 第62回日本植物生理学会年会
• [Presentation] 植物におけるタンパク質大量発現システムを用いた植物ホルモン大量生産系の確立 (2020)
  • Author(s): 三浦謙治
  • Organizer: 「生合成リデザイン」第九回公開シンポジウム
• [Presentation] 植物内タンパク質大量発現技術「つくばシステム」 (2020)
  • Author(s): 三浦謙治
  • Organizer: 第７回アグリテックグランプリ ファイナリスト
• [Presentation] RAPタグとPMab-2 抗体：植物細胞においてタンパク質検出、精製タグシステム (2020)
  • Author(s): 三浦謙治、吉田英樹、金子美華、加藤幸成
  • Organizer: 第61回日本植物生理学会年会
• [Presentation] 硫酸基転移酵素 LGS1 に触媒されるストリゴラクトン生合成経路 (2020)
  • Author(s): 依田彬義，森愛美，謝肖男，米山香織，三浦謙治，秋山康紀，米山弘一，野村崇人
  • Organizer: 第61回日本植物生理学会年会
• [Presentation] かいわれスプラウトのアグロインフィルトレーションを 用いる PLAT ドメイン含有タンパク質の抗昆虫活性の検討 (2020)
  • Author(s): 安田詢子、秋野順治、三浦謙治、北島佐紀人
  • Organizer: 日本農芸化学会2020年度大会
• [Presentation] シラカバ花粉アレルゲン Bet v 1 のベンサミアナタバコ における大量発現 (2020)
  • Author(s): 三浦謙治、山田侑希、木戸口正典、矢田瑛、 中村貴子、吉田英樹、加藤幸宣、増子裕典、檜澤伸之、 藤枝重治、野口恵美子
  • Organizer: 日本農芸化学会2020年度大会
• [Presentation] 一過的タンパク質発現「つくばシステム」 (2019)
  • Author(s): 三浦謙治
  • Organizer: PMPs研究者情報交換会
• [Presentation] 植物における一過的タンパク質大量発現のための「つくばシステム」 (2019)
  • Author(s): 三浦謙治、星川健、江面浩
  • Organizer: 第３７回日本植物細胞分子細胞生物学会（京都）大会
• [Presentation] ベンサミアナタバコ一過的発現系を用いたブラシノステロイド生合成経路の解析 (2019)
  • Author(s): 野村崇人、謝肖男、大西利幸、三浦謙治
  • Organizer: 植物化学調節学会第５４回大会（鳥取）
• [Remarks] 筑波大学 植物分子細胞生物学研究室
  • URL: https://sites.google.com/view/tsukubapmcb
• [Remarks] 筑波大学 生命環境系 生物科学専攻 植物分子細胞生物学研究室
  • URL: https://sites.google.com/view/tsukubapmcb
• [Remarks] 筑波大学 研究者総覧
  • URL: https://trios.tsukuba.ac.jp/researcher/0000001424
• [Remarks] ORCiD
  • URL: https://orcid.org/0000-0003-1262-2176
• [Remarks] Google Scholar
  • URL: https://scholar.google.com/citations?user=e98mJRkAAAAJ&hl=ja
• [Patent(Industrial Property Rights)] 植物細胞における発現システム及びその使用 (2019)
  • Inventor(s): 三浦謙治、星川健、江面浩
  • Industrial Property Rights Holder: 三浦謙治、星川健、江面浩
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2019
  • Acquisition Date: 2021
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞死抑制剤及び細胞死抑制方法 (2019)
  • Inventor(s): 三浦謙治、鶴田文憲
  • Industrial Property Rights Holder: 三浦謙治、鶴田文憲
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2019-142038
  • Filing Date: 2019