Development of coculture method of actimomycetes and animal cells to produce new natural products

• Project Area: Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries
• Project/Area Number: 19H04640
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 石橋 正己 千葉大学, 大学院薬学研究院, 教授 (90212927)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2020: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2019: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: 天然物 / 放線菌 / 培養 / 動物細胞 / ノカルジア / Nocardia

Outline of Research at the Start

放線菌には二次代謝産物の産生に関する生合成遺伝子が多数存在するもののそれら遺伝子の多くは通常休眠状態にあると考えられている．そのため休眠中の遺伝子群を活性化させて新たな二次代謝産物を得ることが重要である．放線菌の一種であるNocardia属は日和見感染症の原因となるグラム陽性細菌である．本属に関する二次代謝産物の研究はStrepotmyces属等に比べ少ないため，本研究では本属由来の独特な化合物（天然物）を見出すことを目的とする．とくに放線菌Nocardia属と動物細胞との“共培養”という新しい方法を介して休眠中の遺伝子群を活性化することにより新たな未知天然物創製技術を開拓することを目指す．

Outline of Annual Research Achievements

１）これまでにNocardia tenerifensis IFM10554T株とマウスマクロファージ様細胞 (J774.1)との共培養を行い，共培養特有に産生され，J774.1に対する細胞毒性（IC50 30.9 μM）を有する環状ペプチドnocarjamide を見出した．今回，本ペプチドの産生に関する経時的変化，培地組成の影響，動物細胞種による産生の変化を精査した．その結果，本ペプチドは共培養3日目に産生されるが，改変Czapek-Dox（mCD）培地からNaNO3とFeSO4を除外した培地では産生されないこと，J774.1細胞の代わりに，ヒト胎児由来腎細胞株HEK293またはヒトT細胞白血病由来細胞株HPB-ALLを用いても同様に産生されることが判明した．
２）76種のNocardia属放線菌を病原因子の遺伝子解析により5種を選別し，J774.1細胞存在下，mCD培地，28 ℃，静置条件にて2週間共培養を行い，抽出物をLC-MSで比較した．その結果，Nocardia arthritidis IFM10035T株に共培養選択的産生ピークを見出したので，本菌の大量培養を行い，抽出エキスから共培養選択的成分を６種単離した．これらは既知環状ペプチドL-Val(6)peptidelipin NAおよび文献未記載の類縁化合物であった．
３）単培養条件では産生しない細胞毒性物質の共培養条件下での産生を期待して，放線菌Nocardia属66種の単培養抽出物をJ774.1に対する細胞毒性を指標にスクリーニングし，細胞毒性を示さなかった菌株についてJ774.1との共培養を行った．その結果，共培養選択的にJ774.1に対して細胞毒性を有する菌株を4株見出した．そのうちの1株Nocardia uniformis IFM0856T株について大量培養を行い，細胞毒性を有する新規化合物を単離した．

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Acacienone, a terpenoid-like natural product having an unprecedented C20 framework isolated from Acacia mangium leaves (2021)
  • Author(s): Yasumasa Hara, Yuichi Totsugi, Hiroshi Ichikawa, Shinji Harada, Kazuki Fujii, Firoj Ahmed, Samir K. Sadhu, Midori A. Arai, Masami Ishibashi
  • Journal Title: Journal of Natural Medicines Volume: 75 Issue: 1 Pages: 99-104
  • DOI: 10.1007/s11418-020-01457-y
  • NAID: 40022463001
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cadinane sesquiterpenoids isolated from Santalum album using a screening program for Wnt signal inhibitory activity (2020)
  • Author(s): Tomoyuki Sato, Midori A. Arai, Yixizhuoma, Yasumasa Hara, Takashi Koyano, Thaworn Kowithayakorn, Masami Ishibashi
  • Journal Title: Journal of Natural Medicines Volume: 74 Issue: 2 Pages: 476-481
  • DOI: 10.1007/s11418-019-01380-x
  • NAID: 40022183696
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Target protein-oriented isolation of Hes1 dimer inhibitors using protein based methods (2020)
  • Author(s): Arai Midori A.、Morita Kaori、Kawano Haruka、Makita Yuna、Hashimoto Manami、Suganami Akiko、Tamura Yutaka、Sadhu Samir K.、Ahmed Firoj、Ishibashi Masami
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 1381-1381
  • DOI: 10.1038/s41598-020-58451-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Isolation and evaluation of cardenolides from Lansium domesticum as Notch inhibitors (2020)
  • Author(s): Anna Tsuchiya, Yoshinori Makita, Takashi Koyano, Thaworn Kowithayakorn, Masami Ishibashi, Midori A. Arai
  • Journal Title: Journal of Natural Medicines Volume: 74 Issue: 4 Pages: 758-766
  • DOI: 10.1007/s11418-020-01432-7
  • NAID: 40022344764
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Total synthesis of lindbladione, a Hes1 dimerization inhibitor and neural stem cell activator isolated from Lindbladia tubulina (2020)
  • Author(s): Arai Midori A.、Makita Yuna、Yamaguchi Yumi、Kawano Haruka、Suganami Akiko、Tamura Yutaka、Ishibashi Masami
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 21433-21433
  • DOI: 10.1038/s41598-020-78524-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Isolation of inohanalactone, a γ-butyrolactone, from Nocardia inohanensis IFM0092T (2020)
  • Author(s): Natsumi Kobayashi, Yasumasa Hara, Midori A. Arai, Shoko Hara, Tohru Gonoi, Takashi Yaguchi, Masami Ishibashi
  • Journal Title: Heterocycles Volume: 101 Issue: 1 Pages: 312-317
  • DOI: 10.3987/com-19-s(f)11
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of BMI1 promoter inhibitors from Streptomyces sp. IFM-11958 (2019)
  • Author(s): Yusuke Yokoyama, Midori A. Arai, Yasumasa Hara, Masami Ishibashi
  • Journal Title: Bioorganic and Medicinal Chemistry Volume: 27 Issue: 13 Pages: 2998-3003
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2019.05.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nonactic acid derivatives isolated from Streptomyces werraensis IFM12104 in a screening program for BMI1 promoter inhibitory activity (2019)
  • Author(s): Yusuke Yokoyama, Midori A. Arai, Yasumasa Hara, Masami Ishibashi
  • Journal Title: Natural Products Communications Volume: 14 Issue: 7 Pages: 1-5
  • DOI: 10.1177/1934578x19866583
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Screening for natural products that affect Wnt signaling activity (2019)
  • Author(s): Masami Ishibashi
  • Journal Title: Journal of Natural Medicines Volume: 73 Issue: 4 Pages: 697-705
  • DOI: 10.1007/s11418-019-01320-9
  • NAID: 40021995151
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sucupiranins M-Q, five new furanocassane-type diterpenoids from the seeds of Bowdichia virgilioides (2019)
  • Author(s): Endo Yuta, Kasahara Taku, Asakura Kenta, Mori Ayana, Funasaki Mariko, Akisue Gokithi, Etoh Tadahiro, Harada Kenichi, Fukuyama Yoshiyasu, Matsuzaki Keiichi, Ishibashi Masami, Ohsaki Ayumi
  • Journal Title: Tetrahedron Volume: 75 Issue: 37 Pages: 130511-130511
  • DOI: 10.1016/j.tet.2019.130511
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 関節リウマチ由来滑膜細胞に選択的にアポトーシス経路を誘導する天然物の探索 (2020)
  • Author(s): 山崎秀太，原康雅，小谷野喬，T. Kowithayakorn，石橋正己
  • Organizer: 第64回日本薬学会関東支部大会
• [Presentation] Andrographis paniculataからの BMI1 プロモーター阻害作用を示す天然物の探索 (2020)
  • Author(s): 藤井一樹，荒井緑，原康雅，S. K. Sadhu，F. Ahmed，石橋正己
  • Organizer: 第64回日本薬学会関東支部大会
• [Presentation] ヘテロ環含有ロカグラミド誘導体の合成とがん細胞への効果 (2020)
  • Author(s): 蒔田吉功，荒井緑，石橋正己
  • Organizer: 第62回天然有機化合物討論会
• [Presentation] 放線菌と動物細胞の共培養による未知天然物創製技術の開拓 (2020)
  • Author(s): 石橋正己
  • Organizer: 生合成リデザイン第九回公開シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Search for new natural products from pathogenic actinomycetes of the genus Nocardia by co-culture with animal cells (2020)
  • Author(s): Yasumasa Hara, Midori A. Arai, Takashi Yaguchi, Masami Ishibashi
  • Organizer: 2nd German-Japanese Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Screening studies for bioactive natural products on disease and development pathways (2019)
  • Author(s): Masami Ishibashi
  • Organizer: The 50th Annual Meeting and Conference of the Korean Society of Pharmacognosy
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Natural products screening study on disease and development signals (2019)
  • Author(s): Masami Ishibashi
  • Organizer: The 1st Pharmaceutical Sciences Asia Conference 2019
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 生物活性天然物化学：細胞シグナルに作用する天然物のスクリーニング (2019)
  • Author(s): 石橋正己
  • Organizer: 日本薬学会北海道支部セミナー
  • Invited
• [Presentation] 植物からの創薬分子のスクリーニング (2019)
  • Author(s): 石橋正己
  • Organizer: 千葉大学植物分子科学研究センター開所記念シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 動物細胞との共培養による病原性放線菌Nocardia属からの天然物探索 (2019)
  • Author(s): 谷村大樹
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第14回年会
• [Presentation] 動物細胞との共培養による病原性放線菌Nocardia属からの新規天然物の探索 (2019)
  • Author(s): 原康雅
  • Organizer: 第3回新学術領域研究「生合成リデザイン」若手シンポジウム,
• [Book] "5.2.1アミノ酸，ペプチドおよびタンパク質"，化学便覧基礎編改訂６版５．２節「生体物質の性質」 (2021)
  • Author(s): 石橋正己
  • Total Pages: 11
  • Publisher: 丸善
  • ISBN: 9784621305218
• [Book] "Target protein-oriented natural products isolation methods", Comprehensive Natural Products Chemistry Ⅲ, Chemistry & Biology (2020)
  • Author(s): Midori A. Arai, Masami Ishibashi
  • Total Pages: 18
  • Publisher: Elsevier
  • ISBN: 9780081026915
• [Remarks] 活性構造化学研究室
  • URL: https://www.p.chiba-u.jp/lab/kassei/index.html